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(共43张PPT)
PCR技术（聚合酶链式反应）ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
5’
3’
TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
5’
解旋酶
解链酶
DNA
解旋解链
合成引物
子链延长
DNA的体内复制基本过程
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
5’
3’
TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
5’
DNA
解旋解链
合成引物
子链延长
GGAUCG
5’
AUCGCG
5’
引物酶
引物酶
DNA的体内复制基本过程
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
5’
3’
TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
5’
DNA
解旋解链
合成引物
子链延长
GGAUCG
5’
AUCGCG
5’
TAGCGCTATCGCATCGACGCT
3’
ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG
3’
DNA
聚合酶
DNA
聚合酶
DNA的体内复制基本过程
1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）
基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制
最初采用E.coliDNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错
耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪
Kary B. Mullis
<of the Polymerase Chain Reaction>>
1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,穆利斯荣获1993年度诺贝尔化学奖。
引物
引物
Mullis的构思
DNA聚合酶
DNA聚合酶
特定DNA片段
Taq DNA聚合酶（Thermus aquaticus)
酶活性(%)
温度(℃)
40 50 60 70 80 90 100
100
80
60
40
20
72℃
94℃
55℃
PCR循环
一、PCR的基本原理
类似于DNA的体内复制。
首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。
PCR技术原理和基本操作
Taq
P1
P2
PCR反应体系
dATP
dTTP
dGTP
dCTP
Mg2+
模板：DNA
引物：P1 P2
DNA聚合酶：Taq
原料：dNTP
反应缓冲液
辅助因子：Mg2+
标准的PCR反应体系：
10×扩增缓冲液 　 10ul　　　
4种dNTP混合物 　 各200umol/L 800ul　　　
引物 　　　　 　 各10～100pmol
模板DNA 　　　 　 0.1～2ug　　 　
Taq DNA聚合酶 　 2.5u　 　　　
Mg2+　　　　　　 1.5mmol/L
加双或三蒸水至 　 100ul
PCR技术的反应条件
Denature template DNA by heat (95 oC)
Target Sequence
Target Sequence
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至95℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
PCR Cycle - Step 1 –
PCR Cycle - Step 2 –
Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequences
Target Sequence
Target Sequence
Primer 1
Primer 2
5’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
3’
②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
PCR Cycle - Step 3 -
At 72 o C Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporated
Target Sequence
Target Sequence
Primer 1
Primer 2
5’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
Taq DNA
Polymerase
③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTPs为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA互补 链。
3’
End of the 1st PCR Cycle –
Results in two copies of target sequence
Target Sequence
Target Sequence
每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
Target Amplification
No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target
1 2
2 4
3 8
4 16
5 32
6 64
20 1,048,576
30 1,073,741,824
1 cycle = 2 Amplicon
2 cycle = 4 Amplicon
3 cycle = 8 Amplicon
4 cycle = 16 Amplicon
5 cycle = 32 Amplicon
6 cycle = 64 Amplicon
7 cycle = 128 Amplicon
1缓冲液10mmol/L Tris-HCl，50mmol/L KCl，pH=8.3-9.0(室温时约为7.2)，还可有添加剂、共溶剂等。Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。二、有关PCR反应体系常识2、脱氧三磷酸核苷(dNTPs)dATP、dGTP、dCTP、dTTP四种的等量混合物。3、引物使用浓度为0.1-0.5 mol/L。浓度过低则产量低，过高则易导致错配。4、模板单、双链DNA均可。一个PCR反应中104至107个模板分子可获得较理想的效果，但由于PCR较灵敏，更少的模板分子数在循环数增加时也会得到大量扩增。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类，模板纯度不高往往是限制PCR扩增的重要因素。5、耐热性的DNA聚合酶有多种，均从耐热性的细菌中分离出来，均耐高温，普遍具有5’→3’聚合酶和5’→3’外切酶活性。常用的有：1）TaqDNA聚合酶2）TthDNA聚合酶3）Vent DNA聚合酶4）PwoDNA聚合酶5）PfuDNA聚合酶6）混合DNA聚合酶。PCR引物的设计一般原则引物长度一般以18～30bp为宜，过短降低特异性，过长会引起退火时结合的模板数减少，降低反应效率。解链温度(Tm值)很重要，直接决定了扩增中可使用的退火温度(Ta值)的高低，两条引物间的Tm值越接近越好。避免引物内部出现二级结构，避免序列内有较长的回文结构。引物3’端为关键碱基，是PCR延伸的起始端，不能进行任何修饰，也不能形成二级结构的可能。要避免两个引物间碱基序列互补以及同一引物自身碱基序列互补。引物5’末端碱基可添加与模板无关的序列(如限制性核酸内切酶的识别序列、ATG起始密码子或启动子序列等)，便于克隆和表达。引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。引物与核酸序列数据库的其它序列均应无明显同源性，以免造成不必要的非特异性扩增。三、PCR反应程序1、常规程序：94℃左右预变性几十秒至几分钟；94℃左右变性10秒至1分钟；50-65℃左右退火30秒至1分钟；20-35个循环72℃左右延伸30秒至几分钟；72℃左右最后延伸和加尾3-10分钟；4-25℃保持3分钟或更长。2、退火和延伸温度：退火温度Ta值由Tm值决定，多数情况下Ta采用Tm减去3-5℃，较高时特异性强但退火效率低，较低时退火效率增加而非特异扩增增加，可根据实际研究目的采用高特异性或低特异性退火。3、反应时间：变性步骤一般为5秒至1分钟，变性温度高时时间短，低时时间长，简单模板时间短，复杂模板时间长。退火时间一般为30秒至1分钟即可，引物结构好的时间短，引物结构差的退火时间宜长。延伸时间从半分钟到10分钟以上不等，由扩增片段的长度和DNA聚合酶的延伸速度共同决定。4、循环次数：多数为25-35，主要取决于模板属性、模板丰度、引物退火效率DNA聚合酶的扩增能力。裸露DNA、杂质少、高丰度模板、引物结构好、DNA聚合酶扩增能力强时，循环数宜少，以尽量减少突变。否则宜多，以保证获得必要的PCR产物量。
1
2
3
4
5
22
55
72
94
时间（min）
温度
（℃）
适温延伸
3
高温变性
1
低温退火
2
重复1~3步
25~30轮
目的DNA片段
扩增100万倍以上
DNA双螺旋
DNA单链
与引物复性
DNA变性
形成2条单链
子链延伸
DNA加倍
模板DNA
95℃
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点
50℃
引物1
引物2
DNA引物
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点
引物1
引物2
DNA引物
72℃
Taq酶
Taq酶
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点
72℃
第1轮结束
第2轮开始
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点
95℃
50℃
72℃
Taq
Taq
Taq
Taq
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点
72℃
第2轮结束
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点
重复30轮后
230=1,073,741,824
模板DNA
第1轮扩增
第2轮扩增
第3轮扩增
第4轮扩增
第5轮扩增
第6轮扩增
理想拷贝数=2n
n 循环次数
实际拷贝数=(1+x)n
X 平均效率,约为0.85
n 循环次数
PCR的特点
灵敏度高
皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平
能从100万个细胞中检出一个靶细胞
病毒检测的灵敏度可达3个RFU
细菌检测的最小检出率为3个细菌
简便、快速
一次性加好反应液，2～4 小时完成扩增
扩增产物一般用电泳分析
对标本的纯度要求低
血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA
PCR操作（录像）
PCR中其它注意的事项
1.防止污染
试剂小量分装
吸头及EP管(离心管)一次性使用
器皿及工作区域要分开，无菌操作
2.设立对照：
阳性对照： 阳性模板
阴性对照： 阴性模板、无模板
试剂对照： 除模板外的所有组分
PCR应用举例
1、在PCR产物两端添加限制性酶切位点
在PCR引物的5’加上根据需要而设计的酶切位点，PCR产物内部无该切点。
在酶切位点的5’加3个左右的保护碱基，其数目多少取决该酶的性质。
PCR产物经电泳回收后，直接用限制酶进行切割，纯化后与目标载体连接重组。
该法适用于直接将PCR产物克隆到表达载体进行功能研究，但构建好的表达载体必须测序才能证明PCR产物的身份正确且没有突变。
2、TA克隆这是目前最通行的PCR产物克隆方法，基本思路是先将PCR产物与特制的T载体进行连接重组，测序证明正确无误后，再从T载体上亚克隆到表达载体上进行功能研究。Taq酶PCR产物的特点：该酶具有末端转移酶活性，通常在其产物DNA分子每条链的3’末端加上一个突出的A。T载体：通过特定制作技术制作的在多克隆位点中间已开环的质粒载体，其每条链的3’末端具有一个突出的T。TA克隆：将3’末端具一个突出的A的PCR产物与T载体连接重组，转化大肠杆菌，对鉴定为阳性的重组克隆子的多克隆位点区的插入片段进行测序，然后再亚克隆到其它载体进行功能研究等。3、反向PCR (reverse PCR)
是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。
可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。
已知序列
未知序列
未知序列
已知序列
未知序列
未知序列
限制酶
限制酶
连接酶
4、利用接头的PCR/锚定PCR (anchored PCR)
将基因组总DNA用限制酶切割，然后将序列已知的接头连接到酶切片段的两端，以提供PCR的锚定引物，该锚定引物与已知序列中的基因特异引物组合后，用于目标基因侧翼序列的扩增。
为了减少锚定引物与锚定引物之间组合后构成的非特异扩增，可以将接头替换为一端平、另一端为5’突变的结构，且对3’凹陷的碱基实行亚氨基修饰。
5、多重PCR (multiplex PCR)：
在一个反应体系中使用一对以上引物的PCR称为多重PCR。其结果是产生多个PCR产物，用于检测特定基因序列的存在或缺失。
电泳
引物
现 嫌1 嫌2 嫌3
父’ 父 子 母
6、PCR-VNTR多态性检测
PCR技术的应用
研究
基因克隆，DNA测序，分析突变
诊断
细菌、病毒、寄生虫检测，诊断
人类基因组工程
遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱
法医
犯罪现场标本分析
肿瘤
各种肿瘤检测
其他……
凡是生命科学领域，PCR都有用武之地。
本课到此结束

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