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第2节 微生物的培养技术及应用
向经过杀菌处理的牛奶中添加某些对人体有益的细菌,再经过发酵就可以制成酸奶。由于制作工艺并不复杂，一些人会在家里自制酸奶。自制酸奶虽然方便，但是食用自制酸奶导致肠胃不适的事例屡见不鲜，主要原因是在制作过程中有杂菌混入。那么，怎样才能保证无处不在的杂菌不混入发酵物中呢
从社会中来
应该先对制作用具和原料进行灭 菌处理，再接种纯的菌种，并控制发酵条件，避免杂菌进入。
一 微生物的基本培养技术
一、培养基的配制
1．培养基的概念：
人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
2．作用：
用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
3．培养基种类
固体培养基
液体培养基
加入凝固剂(如琼脂)
(1)固体培养基中的琼脂仅作为凝固剂，不能为微生物生长提供能量和碳源。
(2)病毒为非细胞结构生物，只能在活细胞中营寄生生活，目前不能利用人工培养基来培养。
4．培养基的营养构成
(1)主要营养物质：
水、碳源(提供碳元素的物质)、氮源(提供氮元素的物质)和无机盐。
(2)某种常见的细菌培养基
——牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成
组分 含量 提供的主要营养
牛肉膏 5 g 碳源、磷酸盐和维生素等
蛋白胨 10 g 氮源和维生素等
NaCl 5 g 无机盐
H2O 定容至1 000 mL 水
(3)还需满足微生物对pH、特殊营养物质以及O2的需求。
例如：
①在培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加维生素；
②在培养霉菌时，一般需要将培养基调至酸性；
③在培养细菌时，一般需要将培养基调至中性或弱碱性；
④在培养厌氧微生物时，需要提供无氧的条件。
二、无菌技术
获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染，主要包括消毒和灭菌。
1．消毒
(1)概念：
指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。
(2)适用对象：
操作的空间、操作者的衣着和手等。
(3)常用方法：
煮沸消毒、巴氏消毒等。
项目 主要方法 应用范围
消 毒 巴氏 消毒法 62～65 ℃消毒30 min或80～90 ℃处理30 s～1 min 牛奶、啤酒、果酒和酱油等不耐高温的液体
煮沸 消毒法 100 ℃煮沸5～6 min 家庭餐具等生活用品
紫外线 消毒 30 W紫外灯照射30 min(损伤细菌的DNA) 接种室、接种箱或超净工作台
化学 药剂 消毒 用体积分数为70%～75%的乙醇、碘酒 皮肤、伤口、动植物组织表面消毒、空气、手术器械、塑料或玻璃器皿
消毒的主要方法及应用范围
2．灭菌
(1)概念：
指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。
(2)适用对象：
用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等。
(3)常用方法：
湿热灭菌、干热灭菌和灼烧灭菌等。
项目 主要方法 应用范围
灭菌 灼烧 灭菌 直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧 涂布器、接种环、接种针或其他金属用具，试管口或瓶口等
干热 灭菌 干热灭菌箱中，160～170 ℃的热空气中维持2～3 h 耐高温的、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿、金属用具等
高压蒸 汽灭菌 (湿热 灭菌) 100 kPa、121 ℃维持15～30 min 培养基等
灭菌的主要方法及应用范围
3.比较消毒和灭菌
项目 消毒 灭菌
作用强度 较为温和 强烈的物理、化学因素
消灭微生物 的数量 物体表面或内部一部分微生物 物体内外的
所有微生物
能否消灭 芽孢、孢子 消灭部分芽孢 能消灭全部
芽孢和孢子
适用对象 操作空间、操作 者的衣着和手等 接种环、接种针、
玻璃器皿、培养基等
常用方法 煮沸消毒法、巴氏 消毒法、化学药剂 消毒法、紫外线消毒法 灼烧灭菌、干热灭菌、
湿热灭菌
三、微生物的纯培养
1．概念：
由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。
2．步骤
微生物的纯培养包括配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤。
探究·实践
酵母菌的纯培养
(一)原理：
微生物群分散或稀释成单个细胞，单个细胞繁殖成单个菌落。
菌落：
分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。
(二)方法：
采用平板划线法和稀释涂布平板法将单个微生物分散在固体培养基上，之后经培养得到的单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。
(三)步骤
(1)制备培养基
配制培养基→灭菌→倒平板。
倒平板注意事项：
①温度：50 ℃左右；
②操作：在酒精灯火焰附近；
③冷凝后平板倒置。
既可以防止水分过快蒸发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉温度下降到刚刚不烫手即可。
(1)如果需要调节培养基的pH，应该在定容完成后，灭菌之前进行操作。
(2)培养基灭菌后要冷却到50 ℃左右时开始倒平板。其原因是琼脂是一种多糖，在98 ℃以上熔化，在44 ℃以下凝固，倒平板时高于50 ℃会烫手，低于50 ℃时，若不及时操作，琼脂会凝固。
(3)倒平板时，要使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰。通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
(4)平板冷却凝固后，要将平板倒置。
(5)在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，那么这个平板不能用来培养微生物，因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
配制培养基的注意事项
(2)接种和分离酵母菌
通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经过数次划线后培养，可以分离得到单菌落。
(1)接种前将接种环放在酒精灯火焰上灼烧。
(2)划线操作在酒精灯火焰旁进行。
(3)接种环蘸取菌液前后，要将试管口通过火焰。
(4)划线时将培养皿的皿盖打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划线，划线后及时盖上皿盖。
平板划线法接种菌种时，可防止杂菌污染的操作
(1)培养未接种的培养基的目的是检测培养基是否被杂菌污染(或检查培养基制备是否合格)。未接种的培养基表面若有菌落生长，则说明培养基被污染，应该重新制备；若无菌落生长，则说明未被污染。
(2)在接种酵母菌的培养基上可观察到独立的菌落，这些菌落在颜色、形状和大小上相似，酵母菌菌落一般表面光滑，多呈乳白色。
(3)若在培养基中观察到不同形态的菌落，原因可能是菌液不纯，混入其他杂菌，或在实验操作过程中被杂菌污染。
(3)培养酵母菌
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28 ℃左右的恒温培养箱中培养24～48 h。
3．实验结果的分析
思考·讨论
1．为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
灼烧时期 目的
取菌种前 杀死接种环上原有微生物
每次划线前 杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞
接种结束后 杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
2.若要按照如图进行划线，那么在接种划线的操作过程中，共灼烧了几次接种环？
思考·讨论
图中共划了5个区域，在每次划线前后均需要对接种环灼烧灭菌，因此共需要灼烧接种环6次。
3.为什么最后一次划线与第一次的划线不能相连？
最后一次划线已经将细菌稀释成单个的细胞，如果与第一次划线相连则增加了细菌的数目，得不到纯化的效果。
思考·讨论
4.设置未接种平板组的意义是什么？
通过观察未接种平板是否有菌落存在以确定培养基是否被污染或灭菌是否彻底。
划线后，线条末端酵母菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使酵母菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细胞繁殖而来的菌落。
5.在第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线的原因是什么？
二 微生物的选择培养和计数
一、选择培养基
1．自然界中目的菌的筛选
(1)实例：
聚合酶链式反应(PCR)中用到的耐高温的DNA聚合酶，就是从热泉中筛选出来的水生栖热菌中提取出来的。
(2)依据：
水生栖热菌能在70～80 ℃的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
2.实验室中目的菌的筛选
①原理：
人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度和pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。
②方法：
利用选择培养基分离。
选择培养基：
允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基
二、微生物的选择培养
1.方法：
对样品进行充分稀释，然后将菌液涂布到制备好的选择培养基上。
2.稀释涂布平板法的操作过程
(1)系列稀释操作
①编号为1×102～1×107试管中分别盛有9 mL无菌水。
②将10 g土样加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。
③取1 mL上清液加入盛有9 mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
9 mL无菌水
取菌液
涂布器消毒
涂布器灭菌
涂布平板
(2)涂布平板操作
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
9 mL无菌水
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入恒温培养箱中培养1～2 d。
3.培养：
三、微生物的数量测定
1.稀释涂布平板法
(1)原理：
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
(2)计数原则：
一般选择菌落数为30～300的平板进行计数。
在一同稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。
(3)结果分析：
统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。
2.显微镜直接计数法
(1)原理
利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。
(2)结果
统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和。
比实际值大
常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数
思考·讨论
1．通常1 g土壤中有几亿到几百亿个土壤微生物，其中，细菌的数量最多，能分解尿素的细菌是其中的一部分。如何设计培养基的配方，从而将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来？
设计一种选择培养基，用尿素作为唯一氮源，可以将分解尿素的细菌分离出来。
2．用平板划线法接种培养结果的图片如下。请结合图片分析，平板划线法能否达到对细菌进行计数的目的？为什么？
不能，平板划线法最开始的划线很可能菌类会长成一片，导致无法计数，此外灼烧接种环的时候也会杀死一部分菌类。
3．当菌液稀释倍数足够高时，培养基表面生长的一个单菌落来源于一个活菌。用稀释涂布平板法接种培养结果的图片如下。与平板划线法相比，为什么稀释涂布平板法可以用于细菌的计数？
思考·讨论
稀释涂布平板法会进行等比稀释，在合适的稀释倍数下，均匀涂布得到的菌落互不接触，可以确定菌类的密度，再通过计算可以得知原液的菌落数。
4．通过稀释涂布平板法统计的细菌的数目与它的实际数目相同吗？
统计的细菌数往往比活菌实际数目低。因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
5．对稀释涂布平板法和显微镜直接计数法进行比较
项目 显微镜直接计数法 稀释涂布平板法
主要用具 显微镜、血细胞计数板或细菌计数板等 培养基等
计数依据 菌株本身 培养基上的菌落数
优点 计数方便、操作简单 计数的都是活菌
缺点 死菌、活菌都计数在内 操作复杂、有一定误差
探究·实践
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1.实验原理
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌，该选择培养基的配方见右栏。
组分 含量
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
琼脂 15.0g
H2O 定容至1000mL
2.方法步骤
(1)土壤取样
在酸碱度接近中性的潮湿土壤，且距地表约3～8 cm的土壤层取样。
(2)样品的稀释
测定土壤中细菌的数量，一般选用1×104、1×105和1×106倍稀释的稀释液进行平板培养，当第一次做这个实验时可以将稀释的范围放宽一点。
(3)微生物的培养与观察
细菌一般在30～37 ℃的温度下培养1～2 d。每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
(1)为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
(2)恰当的稀释度是成功统计菌落数目的关键。
(3)为增强实验说服力与准确性，设计实验时，需要涂布至少三个平板作为重复组，目的是排除实验中偶然因素对实验结果的影响。
(4)分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作有误，需重新实验。
(5)为防止培养时间不足导致菌落遗漏，在菌落计数时，每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
(6)统计的菌落数目往往比活菌实际数目低。
3.注意事项

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