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第2节　动物细胞培养
一 动物细胞培养
从社会中来
在治疗大面积烧伤时，通常采用的方法是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植。但对这样的病人来说，自体健康皮肤非常有限，使用他人皮肤來源又不足，而且会产生免疫排斥反应。那么，怎样才能获得大量的自体健康皮肤 能不能用自体皮肤的单个细胞培养出可供移植的皮肤
通过细胞培养构建的人造皮肤
一 动物细胞培养
一、动物细胞培养
1．动物细胞工程常用技术
动物细胞培养、动物细胞融合和动物细胞核移植等。
(1)常用技术：
(2)基础：
动物细胞培养。
2．动物细胞培养
(1)概念：
从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。
(2)培养条件
①营养
属于合成培养基
将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制而成的培养基。
需加入天然成分：血清。
是液体培养基，即培养液
②无菌、无毒的环境
a．对培养液和所有培养用具进行灭菌处理。
b．在无菌环境下进行操作。
c．培养液需定期更换，以清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。
a.成分：
糖类、氨基酸、无机盐、维生素等。
b.类型：
③温度、pH和渗透压
a．温度：
以36.5 ℃±0.5 ℃为宜。
b．pH：
以pH为7.2～7.4为宜。
c．适宜的渗透压:
④气体环境
O2作用：
细胞代谢所必需的。
CO2主要作用：
维持培养液的pH。
a．动物细胞培养所需气体主要有O2和CO2。
b．在进行细胞培养时，通常采用培养皿或松盖培养瓶， 并将它们置于含有95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中进行培养。
培养皿
培养瓶
CO2培养箱
培养液的渗透压与细胞内液渗透压相等
(3)培养过程
①体外培养的动物细胞类型
悬浮在培养液中生长增殖的细胞
②过程
动物组织块
用机械法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理
分散成单个细胞
问题
细胞分裂受阻
悬浮生长
贴壁生长
原因
原因
细胞密度过大、有害代谢物积累和营养物质缺乏等
接触抑制
解决
传代培养
制成细胞悬液
原代培养
分瓶
①原代培养：指动物组织经处理后的初次培养。
②细胞贴壁：悬液中分散的细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上。
③接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞停止分裂增殖的现象。
④传代培养：分瓶后的细胞培养。
单层贴壁的猪输卵管上皮细胞
贴附于某些基质表面生长增殖的细胞
思考·讨论
有关动物细胞培养的问题
1.幼龄动物的细胞与老龄动物的细胞比较，分化程度低的细胞与分化程度高的细胞比较，哪些细胞更易于培养 为什么
幼龄动物的细胞和分化程度低的细胞更易培养，原因是这些细胞分裂能力强。
2.动物细胞培养时，除了添加糖类、氨基酸等必要的营养成分外，往往还需添加血清等一些天然成分。为什么？
人们对细胞所需的营养物质尚未全部研究清楚，血清等一些天然成分的营养成分比较齐全，可以弥补人工培养基的不足。
3．进行动物细胞传代培养时用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是什么？用胃蛋白酶可以吗？为什么
思考·讨论
蛋白质；不可以；多数动物细胞生存的适宜pH为7.2～7.4，胃蛋白酶(适宜pH为1.5左右)在此环境中没有活性，而胰蛋白酶在此环境中活性较高，因此胰蛋白酶适用于细胞培养时的处理。
有关动物细胞培养的问题
1．动物细胞培养的相关处理
(1)使细胞分散开的原因：一是能保证细胞所需要的营养供应；二是能保证细胞内有害代谢物的及时排出。
(2)使用胰蛋白酶时，要控制好作用时间，因为胰蛋白酶不仅能分解细胞间的蛋白质，长时间作用还会分解细胞膜蛋白等，对细胞造成损伤。进行动物细胞培养时不能用胃蛋白酶分散细胞，主要是因为pH不合适。
核心归纳
(3)动物细胞的整个培养过程中可能多次用到胰蛋白酶或胶原蛋白酶，第一次使用的目的是使组织细胞分散开；贴壁细胞传代培养时使用的目的是使细胞从瓶壁上脱离下来，分散成单个细胞，便于分瓶后继续培养。
(4)①悬浮生长细胞：原代培养→分裂受阻→离心法收集→制成细胞悬液传代培养。
②贴壁生长细胞：原代培养→分裂受阻→胰蛋白酶处理→离心法收集→制成细胞悬液传代培养。
核心归纳
核心归纳
2．植物组织培养与动物细胞培养的比较
比较项目 植物组织培养 动物细胞培养
原理 植物细胞的全能性 细胞增殖
培养基 固体培养基 液体培养基
过程 外植体 ↓脱分化 愈伤组织 　↓再分化 芽、根或胚状体 ↓生长发育 植物体 动物的组织
　　　　　↓机械法或酶
细胞悬液
↓
原代培养
↓
细胞悬液
↓
传代培养
结果 新的植株 新的细胞
相同点 ①两技术手段培养过程中都进行有丝分裂，都不涉及减数分裂； ②均需要无菌操作、无菌培养，需要适宜的温度、pH等条件 二、干细胞培养及其应用
电镜下的胚胎干细胞(照片经后期人工上色处理，放大约1 500倍)
1．来源：
早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中。
2．类型：
胚胎干细胞和成体干细胞等。
3．胚胎干细胞(简称ES细胞)
(1)概念：
存在于早期胚胎中，具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。
(2)局限：
胚胎干细胞必须从胚胎中获取，这涉及伦理问题，因而限制了它在医学上的应用。
4．成体干细胞
(1)概念：
成体组织或器官内的干细胞。
(2)类型
(3)特点：
具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力。
(4)作用：
有着自我更新能力及分化潜能的干细胞，与组织、器官的发育、再生和修复等密切相关。
(5)应用
①造血干细胞：
治疗白血病、一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病。
②神经干细胞：
治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病(如帕金森病、阿尔茨海默病等)。
5．诱导多能干细胞
(1)概念：
通过体外诱导成纤维等细胞，获得类似胚胎干细胞的一种细胞，被称为诱导多能干细胞(简称iPS细胞)。
取成纤维细胞等
转入相关因子
细胞发生转化
神经元
iPS细胞
血细胞
胰岛细胞
移植
分化
肠上皮细胞
肝细胞
心肌细胞
(2)应用
治疗小鼠的镰状细胞贫血；现在用iPS细胞治疗阿尔茨海默病、心血管疾病等领域的研究也取得了新进展。
(3)优点：
无需破坏胚胎；iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应。
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