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第2节　动物细胞培养
二 动物细胞融合技术与单克隆抗体
一、动物细胞融合技术
1．概念：
使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。
2．原理：
细胞膜的流动性。
3．诱导融合的方法
PEG融合法
电融合法
灭活病毒诱导法
用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程
细胞核
病毒颗粒
细胞核
灭活是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但不破坏它们的抗原结构。
4．意义：
细胞融合技术突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。
5．应用
(1)成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。
(2)用于制造单克隆抗体。
动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较
1．19世纪30年代，科学家曾在患肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中，观察到多核细胞。如何解释这一现象？
病人体内的病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。
2．比较动物细胞融合技术和植物体细胞杂交技术
(1)动物细胞融合和植物体细胞杂交技术的原理分别是什么？
动物细胞融合的原理是细胞膜的流动性；
植物体细胞杂交技术的原理是细胞膜的流动性和植物细胞的全能性。
(2)两者在方法上有什么异同？
都可用聚乙二醇(PEG)融合法和电融合法诱导融合；但动物细胞还可用灭活病毒诱导法诱导细胞融合。
(3)两者在最终结果上有什么不同？
动物细胞融合最终得到的是杂交细胞，而植物体细胞杂交技术最终得到的是杂种植株。
思考·讨论
动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较
比较项目 植物体细胞杂交 动物细胞融合
原理 细胞膜的流动性、细胞的全能性 细胞膜的流动性
步骤 酶解法去掉细胞壁后，诱导原生质体融合，形成杂种细胞，再经植物组织培养形成杂种植株 分散成单个细胞后诱导细胞融合，形成杂交细胞
方法 聚乙二醇(PEG)融合法、高Ca2＋—高pH融合法、电融合法、离心法 PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法
结果 形成杂种植株 形成杂交细胞，以生产细胞产品
意义 打破生殖隔离，实现远缘杂交育种 突破有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能
核心归纳
二、单克隆抗体及其应用
1．传统抗体的获得
(1)方法：
向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物血清中分离所需抗体。
(2)缺陷：
产量低、纯度低、特异性差。
2．单克隆抗体的制备
(1)制备原理
①B淋巴细胞特点：
一种B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体，B淋巴细胞在体外不能无限增殖。
②骨髓瘤细胞特点：
能大量增殖，但不能产生抗体。
③杂交瘤细胞特点：
B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合得到的杂交瘤细胞，既能大量增殖，又能产生足够数量的特定抗体。
用96孔板培养和筛选杂交瘤细胞(每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞)
(2)制备过程
用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞。
注射特定的抗原
培养骨髓瘤细胞
多种B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
多种杂交细胞
诱导融合
将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合
用特定的选择培养基进行筛选:在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。
对上述经选择培养的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选，就可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞(分泌的抗体能与特定抗原结合)
杂交瘤细胞(既能迅速大量增殖，又能产生抗体)
从细胞培养液或小鼠腹水中获取大量的单克隆抗体。
单克隆抗体
多种杂交细胞
(2)制备过程
注射到小鼠腹腔内
体外培养
将抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞在体外条件下大规模培养，或注射到小鼠腹腔内增殖。
核心归纳
单克隆抗体制备的过程
核心探讨
1．给小鼠注射特定抗原的目的是什么？
目的是能从该小鼠的脾中得到可以产生特定抗体的B淋巴细胞。
2．B淋巴细胞与骨髓瘤细胞经诱导融合后，培养基中共出现几种细胞？其中融合的细胞有几种？(如融合的话，只考虑两两融合)
共有5种细胞；其中融合的细胞有3种。
3．单克隆抗体制备过程中，第一次筛选的目的是什么？方法是什么？
目的是筛选出杂交瘤细胞；方法是用选择培养基进行筛选。
4．单克隆抗体制备过程中，第二次筛选的目的是什么？方法是什么？其原理是什么？
目的是筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞；方法是抗体检测；其原理是抗原—抗体的特异性结合。
比较项目 第一次筛选 第二次筛选
筛选原因 诱导融合后得到多种融合细胞，还有未融合的细胞等 由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经选择培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞
筛选目的 筛选出杂交瘤细胞 筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
筛选方法 用特定的选择培养基筛选；未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长 用96孔板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选得到足够数量的能分泌所需抗体的细胞
单克隆抗体制备过程中两次筛选的比较
核心归纳
思考·讨论
单克隆抗体的应用
细胞凋亡
ADC的作用机制示意图
①
ADC被细胞吞噬
②
⑤
ADC
抗体
药物
接头
思考·讨论
(1)ADC的抗体和药物各具有什么作用
(2)除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物
抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞;药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。
可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗。一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗。
思考·讨论
(3)单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势
(4)单克隆抗体在临床上还有哪些应用
单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高;生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用，有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒。ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。
单克隆抗体在临床 上的应用涉及治疗、诊断等方面。单克隆抗体药物已被广泛用于肿瘤、自身免疫病等疾病的治疗，如利妥昔单抗被用于治疗复发难治的低分化B细胞淋巴瘤;曲妥珠单抗被用于治疗乳腺癌等。在临床诊断方面，单克隆抗体被广泛用于一些感染性疾病的检测、肿瘤的诊断、激素和细胞因子的测定等。以单克隆抗体在诊断肿瘤方面的应用为例，用放射性同位索或荧光标记抗肿瘤表面抗原的单克隆抗体，可以用这些抗体来对体内的肿瘤进行定位，辅助诊断并确定肿瘤的复发与转移等。
3．单克隆抗体的优点
(1)能准确地识别抗原的细微差异。
(2)与特定抗原发生特异性结合。
(3)可以大量制备。
4．单克隆抗体的应用
(1)作为诊断试剂，如定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。
(2)运载药物，如ADC。
(3)治疗疾病。
资料：
(1)细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基蝶呤阻断。
(2)免疫的B淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但它不能分裂增殖，其本身也不能在体外长期存活。
(3)鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径，但它能不断分裂增殖。如果它的D途径被阻断的话，它会因不能合成DNA而死。
请根据上述资料提出筛选出杂交瘤细胞的方法？
培养基中加入氨基蝶呤。
思考·讨论
归纳总结
(1)与植物原生质体融合相比，动物细胞融合特有的诱导因素有聚乙二醇(PEG)、灭活的病毒(　　)
(2)灭活的含义是用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构(　　)
(3)二倍体动物细胞融合后的杂交细胞仍然是二倍体细胞(　　)
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辨析易错易混

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