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动物细胞培养
在治疗大面积烧伤时，通常采用的办法是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植。
克隆皮肤
但对这样的病人来说，自体健康皮肤非常有限，使用他人皮肤来源又不足，而且产生免疫排斥反应。
那么，怎样才能获得大量的自体健康皮肤？能不能用自体皮肤的单个细胞培养出可供移植的皮肤？
从社会中来
问题探讨
在治疗大面积烧伤时，通常采用的方法是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植。
但对这样的病人来说，自体健康皮肤非常有限，使用他人皮肤来源又不足，而且会产生免疫排斥反应。
讨论：
1.怎样才能获得大量的自体健康皮肤？
能不能用自体皮肤的单个细胞培养出可供移植的皮肤？
可以从病人身上取少量正常、健康的皮肤在体外进行培养、扩增；
目前，科学家还在研究对皮肤干细胞进行培养，以获得适合临床上使用的人造皮肤；
————动物细胞培养
动物细胞培养
动物细胞核移植
动物细胞融合
动物细胞工程
是最基础的技术
1、概念：
从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适当的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。
2、目的：
获得细胞或细胞产物；不能获得完整动物个体。
3、原理：
细胞增殖（有丝分裂）
4、实例：
克隆皮肤
皮肤烧伤
那么，获得这些细胞或细胞产物的具体过程又是怎样的？
动物细胞培养
一、动物细胞培养的过程
阅读教材P44页并结合动物细胞培养的定义，相互讨论，
相关关键词和箭头表达出一般过程。
小组合作
胚胎或幼龄动物器官组织
取出组织剪碎
单个细胞
细胞悬液
加培养液
原代培养
转入
原代培养
传代培养
一、动物细胞培养的过程
胰蛋白酶处理
传代培养
动物胚胎或幼龄动物的组织、器官
单个细胞
细胞悬浮液
10代细胞
少部分突破细胞寿限“癌变”，无限传代
动物细胞培养不能最终培养成动物体
50代细胞
原代培养
传代培养
细胞贴壁
剥离、分瓶
细胞
分化程度低，增殖能力强
去掉组织间蛋白
加培养液
胰蛋白酶
剪碎
出现接触抑制
一、动物细胞培养的过程
一、动物细胞培养的过程
（1）为什么选取幼龄动物的组织、器官作为材料？
思考讨论
因为其细胞的分化程度较低，增殖能力较强，有丝分裂旺盛，容易培养
（2）如何将组织、器官分散成单个细胞？
剪刀剪碎（机械法），再用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理
一、动物细胞培养的过程
思考讨论
（3）为何要将组织、器官分散成单个细胞？
①成块组织中细胞与细胞靠在一起，彼此限制了生长与增殖
②利于与培养液充分接触，保证O2与营养供应和代谢物及时排出。
一、动物细胞培养的过程
（4）将组织分散成单个细胞时为什么要用胰蛋白酶（或胶原蛋白酶）
处理？胃蛋白酶可以吗？
思考讨论
胰蛋白酶可以将动物组织细胞间的蛋白质成分酶解，使细胞分散开，获得单个细胞。
纤维蛋白、胶原蛋白等
不可以；胃蛋白酶作用的适宜pH约为2，当pH大于6时，胃蛋白酶就会失去活性，多数动物细胞培养的适宜pH为7.2-7.4，胃蛋白酶在此环境中没有活性，所以用胃蛋白酶不行。
细胞膜含有蛋白质，长时间处理会损伤细胞
要控制好时间
一、动物细胞培养的过程
（5）酶解法较温和，一定不会对动物细胞造成损伤，对吗？
思考讨论
一、动物细胞培养的过程
思考讨论
（6）如何让将分散的细胞制成细胞悬液？
用培养液将细胞制成细胞悬液
一、动物细胞培养的过程
（7）动物细胞分裂生长具有什么类型？
思考讨论
①能够悬浮在培养液中生长增殖
②大多数需要贴附于某些基质表面才能生长增殖（细胞贴壁）
资料：动物细胞生长特性
细胞贴壁
一、动物细胞培养的过程
培养过程中出现了几个特点：
要求：（培养瓶（皿）内表面光滑、无毒、易于贴附）
细胞的接触抑制
悬液中分散的细胞贴附在瓶壁生长的现象；
当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖的现象
一、动物细胞培养的过程
（1）细胞贴壁
（2）接触抑制
癌细胞；
癌细胞的细胞膜上糖蛋白等物质减少
三、动物细胞培养的过程
“细胞增殖到互相接触的时候，糖蛋白识别了这种信息，就会使细胞停止继续繁殖，出现接触抑制的现象”试结合上述解释，举例说明哪种细胞无接触抑制现象，并阐述原因。
思考
一、动物细胞培养的过程
（7）你是如何理解原代培养和传代培养的？
思考讨论
原代培养 传代培养
概念
核型是否改变
动物组织消化后的初次培养
贴满瓶壁的细胞，分瓶继续培养
核型正常
部分细胞核型改变
10代细胞以内
10代以后的细胞
一、动物细胞培养的过程
（8）需分瓶进行传代培养的原因是什么 ？
思考讨论
悬浮培养的细胞会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质等因素而分裂受阻，贴壁细胞在生长增殖时，除受上述因素影响外，还会发生接触抑制现象
（9）分瓶的具体做法 ？
重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集
将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养
在沉淀中得到细胞，同时去掉上清液中的胰蛋白酶
未体现；
动物细胞培养只是细胞增殖的过程
三、动物细胞培养的过程
1.离心的作用？
思考
2.动物细胞培养技术有没有体现动物细胞的全能性？
细胞株和细胞系
原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到40~50代，这种传代细胞为细胞株。
细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。
细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。
一、动物细胞培养的过程
细胞株
细胞系
区别：
模拟
动物细胞培养条件：
营养
无菌、无毒环境
温度和pH
气体环境
无菌处理
抗生素
更换培养液
糖、氨基酸、无机盐、促生长因子、微量元素、动物血清等
36.5±0.5℃
7.2-7.4
95%空气和5% CO2
体外培养细胞需要提供的营养物质：
体外培养细胞时需要提供适宜的环境条件：
内环境中还有些成分尚未研究清楚，血清提供一个类似生物体内的环境
葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、促生长因子、微量元素（合成培养基）+动物血清等
①培养液和所有培养用具灭菌处理，无菌操作。
②添加一定量的抗生素
③定期更换培养液，防止代谢物积累伤害细胞。
温度36.5+0.5度，pH7.2～7.4，也需考虑渗透压因素。
O2和CO2（95%空气和5% CO2 ）
二、动物细胞培养的条件
营养：
1
无菌、无毒的环境：
2
温度、PH和渗透压：
3
气体环境：
4
O2和CO2的作用分别是什么？
为什么对动物细胞进行培养时通常要添加血清？
补充资料：
1、血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等，
2、氨基酸有多种，是细胞合成蛋白质的基本成分，其中有些氨基酸动物
细胞本身不能合成（称为必需氨基酸），必须由培养液提供。
3、血清激素有胰岛素、生长激素等及多种生长因子；血清还含有多种未
知的促细胞生长因子、 促贴附因子及其他活性物质，能促进细胞的
生长、增殖和贴附。
4、因此，细胞培养时，要保证细胞能够顺利生长和增殖，一般需添加
10%～20%的血清。
血清中含有多种未知的促细胞生长因子等营养物质，这是细胞生长和增殖所必需的。
二、动物细胞培养的条件
二、动物细胞培养的条件
动物细胞培养与植物组织培养有什么相同和不同之处？
思考讨论
动物胚胎或幼龄动物的组织、器官
细胞悬浮液
胰蛋白酶
10代细胞
50代细胞
无限传代
单个细胞
加培养液
植物组织培养和动物细胞培养的比较
离体的植物器官、组织或细胞
愈伤组织
根、芽
植物体
脱分化
再分化
接种至培养基
动物细胞培养
植物组织培养
二、动物细胞培养的条件
比较项目 植物组织培养 动物细胞培养
原理
培养基性质
培养基特有成分
培养结果
培养目的
获得细胞及代谢产物
细胞的全能性
细胞株、细胞系
植物体
快速繁殖、培育无病毒植株等
葡萄糖、动物血清
蔗糖、植物激素
液体培养基
固体培养基
细胞增殖
二、动物细胞培养的条件
植物组织培养和动物细胞培养的比较
干细胞包括____________和____________等
（1）胚胎干细胞（简称ES细胞）
①分布：存在于__________中
②特点
__________________________________________
__________________________________________
③应用实例
__________________________________________
干细胞存在于_________、______和________等多种组织和器官中；
早期胚胎
骨髓
脐带血
胚胎干细胞
成体干细胞
早期胚胎
具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能
ES细胞在体外分化成心肌细胞、神经元细胞和造血干细胞等
五、干细胞培养及其应用
2.分布
3.分类
1.定义
是一类具有多向分化潜能和自我复制能力的原始的未分化细胞
②体外培养时，可以只增殖而不分化，冷冻保存或遗传改造
（2）成体干细胞
①分布：存在于__________________中
②常见类别：包括______中的___________、_________中的__________、____中的___________等；
③特点
__________________________________________
__________________________________________
④发现最早、研究最多的、应用最成熟的实例
__________________________________________
成体组织或器官内
骨髓
造血干细胞
神经系统
神经干细胞
睾丸
精原干细胞
一般认为，成体干细胞具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力
造血干细胞，主要存在于成体的骨髓、外周血和脐带血中
五、干细胞培养及其应用
有着_________能力及______潜能的干细胞，与__________的_______________
等密切相关；
自我更新
分化
组织、器官
发育、再生和修复
类型 应用
造血干细胞
神经干细胞
诱导多能干细胞（iPS细胞）
治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病
治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）
可治疗小鼠的镰状细胞贫血症，在治疗阿尔兹海默病、心血管疾病等领域的研究也取得了新进展
导致肿瘤发生的风险
五、干细胞培养及其应用
3.干细胞的应用
4.干细胞应用面临的问题
存在_____________________
胚胎干细胞必须从_____中获取 ，涉及________；
通过体外诱导__________，获得________________的一种细胞，称为诱导多能干细胞，简称________。
①诱导过程_____________
②iPS细胞可以________________________，将它移植回病人体内后，理论上可以_________________；
胚胎
伦理问题
成纤维细胞
类似胚胎干细胞
iPS细胞
无需破坏胚胎
来源于病人自身的体细胞
避免免疫排斥反应
*因此，普遍认为iPS细胞的应用前景优于胚胎干细胞
六、诱导多能干细胞
1.胚胎干细胞的局限性
2.诱导多能干细胞概念
3.诱导多能干细胞优点
取成纤维细胞
转入相关因子
细胞转化为iPS细胞
诱导iPS细胞定向分化为多种组织细胞
移植回病人体内
六、诱导多能干细胞
4.应用
①______________________________________
②______________________________________
③______________________________________
______________________________________
借助载体将特定基因导入细胞中诱导形成iPS细胞
直接将特定蛋白导入受体细胞中诱导形成iPS细胞
用小分子化合物来诱导形成iPS细胞诱导形成iPS细胞
成纤维细胞以及已分化的T细胞、B细胞
六、诱导多能干细胞
5.制备iPS细胞的其他方法
6.iPS细胞的来源
③体外培养时，可以只增殖而不分化，冷冻保存或遗传改造
①体积小、细胞核大、核仁明显
三、干细胞培养及其应用
（1）胚胎干细胞：
（1）特点：
胚胎干细胞是早期胚胎（原肠胚期之前）或原始性腺中分离出来的一类细胞，具有分化成为成年动物体内任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。
②具有发育的全能性
（2）来源：
EG 细胞和ES细胞
①体积小、细胞核大、核仁明显
三、干细胞培养及其应用
B.成体干细胞：
存在于一种已经分化组织中的未分化细胞，这种细胞能够自我更新并且能够特化形成组成该类型组织的细胞。成体干细胞存在于机体的各种组织器官中。
②具有发育的全能性
（2）来源：
EG 细胞和ES细胞
(1)成体干细胞类型：
造血干细胞
神经干细胞
精原干细胞
干细胞可以被诱导分化形成新的组织细胞，经移植可使坏死或退化部位得以修复并恢复正常功能
五、干细胞培养及其应用
干细胞可以治疗某些顽症的原理是什么？
思考
1.如果想将iPS细胞用于紧急情况，应该提前采取什么措施？
思考
六、诱导多能干细胞
建立iPS细胞库（HLA多态性丰富的iPS细胞库），可以为需要的人找到HLA匹配度较高的iPS细胞
4、胚胎干细胞应用：
体外诱导小鼠成纤维细胞
诱导多能干细胞
iPS
临床治疗人类疾病
多种体细胞
定向诱导分化
如：白血病、帕金森病、阿而茨海默病等
三、干细胞培养及其应用
①______________________________________
②______________________________________
③______________________________________
______________________________________
借助载体将特定基因导入细胞中诱导形成iPS细胞
直接将特定蛋白导入受体细胞中诱导形成iPS细胞
用小分子化合物来诱导形成iPS细胞诱导形成iPS细胞
成纤维细胞以及已分化的T细胞、B细胞
六、诱导多能干细胞
5.制备iPS细胞的其他方法
6.iPS细胞的来源
思考
六、诱导多能干细胞
2.如果诱导iPS细胞定向分化为生殖细胞的技术发展成熟，该技术可能会有哪些应用？又可能带来哪些问题？
可以用来治疗不孕症；
可以用来进行濒危物种的克隆；
可以对获得的生殖细胞进行转基因操作，再经过受精、胚胎发育等过程来获得转基因动物；
可能会带来一系列的伦理问题，例如用同一个人的iPS细胞分别诱导形成精子和卵子，两者受精可能培育出“单亲”婴儿，有的人还可能有目的地选择iPS细胞，从而”设计”婴儿
人的核移植胚胎干细胞经诱导分化，形成相应的组织、器官后，可用于组织器官的移植。
干细胞将在再生医学、药物安全性与有效性检测等领域发挥大作用。
谢谢观看!

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