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纯净的目标微生物可通过分离和纯化获得
第2节
浙科版 选择性必修3
1.能概述平板划线法和稀释涂布平板法的原理、操作和用途，能够熟练掌握接种、培养并分离酵母菌的实验方法
2.能理解显微镜计数法的原理和操作
3.能说明利用选择培养基筛选微生物的原理，并掌握能分解尿素的微生物的分离与计数实验原理和操作
目标微生物的分离和纯化
在固体培养基上采用划线或稀释涂布的方法接种，可获得单菌落
由一个细胞分裂形成的、肉眼可见的、有一定形态构造的子细胞集团，这样的细胞集团称为单菌落。
1.平板划线法
(1)原理：
单个细胞
微生物群
单个菌落
连续划线
分散
生长繁殖
（2）方式：
A.连续平行划线
------ 每划一条线都要将接种环在酒精灯的火焰上灭菌
B.扇形划线
C.多次连续平行划线
------ 划线可分3~4次进行，不需再次蘸取菌种，只需在上次划线的末端区域直接开始划线即可。
----从一点出发，向左右连续划平行线
“平板划线”实验操作
1、将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。
2、在火焰旁冷却接种环，并拔出装有酵母菌的棉塞
3、将试管口通过火焰
4、将已冷却的接种环伸入菌液中，蘸取一环菌液
5、将试管通过火焰，并塞上棉塞
6、左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基
7、灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连
8、将平板倒置放入培养箱中培养。
划3个平板（重复实验）1个不划线（空白对照）
第1区划线
接种环灭菌
第2区划线
接种环灭菌
第3区划线
接种环灭菌
接种环灭菌
1
2
3
4
5
①接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次.
②划线首尾不能相接
③每次划线前接种环进行灭菌
④划线后,培养皿倒置培养
平板划线法注意事项:
灼烧时期 目的
取菌种前
每次划线前
接种结束后
（1）为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时,仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
问题讨论
杀死接种环上原有微生物
杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞
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2.稀释涂布平板法
先将菌液进行梯度稀释
不同稀释度的菌液各取0.1ml，加在固体培养基表面
用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面上进行培养
稀释度适当的培养基表面能得到单菌落
根据菌落的形状、大小、颜色、边缘或表面光滑与否等特征可以选取目标微生物继续培养
①铲取土样，将样品装入纸袋中
②将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。
1mL
1ⅹ10
90mL无菌水
1ⅹ107
1ⅹ105
1ⅹ106
1ⅹ103
1ⅹ102
1ⅹ104
1mL
1mL
1mL
1mL
9mL无菌水
1mL
③取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
稀释涂布平板法的操作过程
取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌
④取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。
⑤将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
⑥将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
⑦用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，培养
微生物数量的测定
如何准确测定微生物的数量？
一是在保证能准确计数的前提下减小稀释度；
二是将相同稀释度下多组数值取平均值后再计算
方法：稀释涂布平板法和显微镜计数法
1.稀释涂布平板法
选择30-300个菌落的平板进行计数；
每个稀释度至少取3个平板取其平均值；
统计的菌落往往比活菌的实际数目低；
统计的结果一般用菌落数而不是活菌数；
恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。
分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作有误，需重新实验。
（1）计数原则
（2）计算：
每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M
M代表稀释倍数；
C代表某一稀释度下3个平板上生长的平均菌落数；
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)
例：甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？
（80+90+100）/3
0.1
× 105 =9 ×107个
两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释
倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。
1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。
2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。
你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？
甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）
乙：其中一个平板计数结果与其他两个相差太大，操作过程可能出现了错误。
这种方法是利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量
2.直接计数 —计数板计数法
（1）计数原则
“数上不数下”“数左不数右”
每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数
缺点：
不能区分死菌与活菌，
不适于对运动细菌的计数
“五点取样”
（2）使用方法
先盖好盖玻片
再滴加摇匀的菌液
“五点取样”计数
避免菌液滴到盖玻片
注意防止产生气泡
调整培养基的配方和培养方式可有目的地培养某种微生物
1.微生物的代谢类型不尽相同
能利用光能或化学能合成有机物----自养型。如蓝细菌
有些微生物以现成的有机物为食----异养型。
有些微生物为需氧型、有些为厌氧型
有些微生物能固氮，而大多数不能以N2作为氮源
有些菌株由于突变或人工诱变后丧失合成某种特定化合物的能力
蓝细菌
大多数细菌、真菌和原生动物
2.微生物的代谢方式不唯一
有些不以CO2为唯一（或主要的）碳源
自养型微生物也并非不能利用有机物生长
可将CO2转变为有机物
利用有机物生长
利用光生长
紫色非硫细菌
没有有机物
有有机物
有光照和无氧条件
黑暗和有氧条件
依靠有机物生长
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3.培养基中营养物质的浓度及比例都会影响微生物的生长。
----不能满足微生物生长的需要
培养基的C/N
----抑制微生物的生长
蔗糖浓度
过高
过低
培养基的N/P会影响微生物的生长繁殖
微囊藻在氮磷比为4.5时生长最好
颤藻在氮磷比为0.45时生长最好
为4:1时----菌体大量繁殖
为3:1时----菌体繁殖减缓
2024/1/24
如何培养光能自养型的微生物？
只有了解微生物的代谢特点，才能更有针对性地为目标微生物提供所需的生长条件，更好地培养微生物。
4.选择培养基
在培养基中添加（或减去）某种化学成分，使得只有某些特定的微生物能够生长，其他微生物均不能生长，这样的培养基称为选择培养基。
例：
在培养基中添加青霉素后，只有对青霉素有抗性的细菌才能生长
在不添加任何氮源的培养基上，只有能固氮的微生物才能生长
2024/1/24
当培养基中只有尿素作为氮源时，只有______________的微生物才能在该培养基中生长；微生物可以通过脲酶将尿素降解为氨，作为其生长的________；分解尿素产生的氨会使培养基的碱性增强，加入__________，可进一步鉴定尿素分解菌
实验原理
1.利用______________ 分离能产生脲酶的微生物
2.观察微生物代谢改变环境pH的现象
3.利用________________ 法对微生物进行计数
目的要求
活动:能分解尿素的微生物的分离与计数
能分泌脲酶
氮源
酚红指示剂
稀释涂布平板
选择培养基
小提示 实验过程中要注意无菌操作,如在酒精灯的火焰旁进行倒平板、接种,实验器具的灭菌以及超净工作台的消毒等。
1.在“能分解尿素的微生物的分离与计数”实验中,为什么要制备两种培养基(LB固体培养基和尿素固体培养基)
【思考】
提示：两种培养基形成对照,判断尿素固体培养基是否具有选择作用。
2.如何对土壤悬液进行梯度稀释
提示：将1 g土样加入99 mL无菌水中,振荡后即成10-2稀释液。取上清液1 mL,转移至9 mL无菌水中,制备出10-3稀释液,摇匀。依此方法制备出10-4、10-5、10-6、10-7稀释液。
微生物的分离和纯化
微生物的分离
平板划线法
涂布稀释法
微生物的数量测定
间接计数法 — 稀释涂布平板法
直接计数 —计数板计数法
微生物的有目的地培养

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