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基因工程赋予生物新的遗传特性
第2课时
第1节
浙科版 选择性必修3
1.能阐明PCR的原理，反应所需的条件和PCR反应的过程
2.尝试PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定
1.启动子：
2.终止子：
位于基因的“上游”，有RNA聚合酶结合的位点，控制转录的开始；
位于基因末端，当RNA聚合酶到达时，释放出RNA产物，转录结束。
真核、原核基因的结构
3.编码序列
（1）原核基因中编码蛋白质的序列是连续的
（2）真核基因中编码蛋白质的序列是不连续的。编码蛋白质的序列称为外显子，外显子之间不能编码蛋白质的序列称为内含子。
（3）真核基因和原核基因的表达
真核基因的外显子和内含子均会被转录
真核细胞转录形成的RNA需要经过加工，才可用于翻译
原核细胞转录形成的RNA，不需要加工，可直接用于翻译
一、基因工程的基本操作步骤
获取目的基因
构建重组DNA分子
将重组DNA分子导入受体细胞
检测目的基因及其表达产物
目的基因的获取
二、目的基因的获取
目的基因：人们感兴趣、想研究的基因，主要是指编码蛋白质的基因
目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因（抗病毒、抗细菌)、人胰岛素基因、人干扰素基因等。
目的基因
“杀虫基因”—Bt抗虫蛋白基因
2024/1/24
（一）获取目的基因的方法
1.化学合成法
①需要仪器：DNA合成仪。
②适用目的基因类型：要获取的基因比较小，核苷酸序列又已知；
③不需要模板。
把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别与载体组合，导入微生物细胞，形成克隆，基因组中所有DNA序列克隆的总汇称为基因文库。
2.构建基因文库来获取目的基因
（1）基因组文库
（2）cDNA文库
①基因组文库：含有一种生物的全部基因。
提取某种生物的全部DNA
用适当的限制酶酶切
一定大小的DNA片段
将DNA片段与载体连接
基因表达载体
导入受体菌中储存
基因组文库
②部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库。
提取某种生物的某器官或特定发育时期的mRNA
反（逆）转录酶
单链互补DNA
DNA聚合酶
双链DNA片段
与载体连接
基因表达载体
导入受体菌中储存
cDNA文库
真核细胞的cDNA的获取
编码区
非编码区
非编码区
DNA聚合酶
剪接有关的酶
RNA聚合酶
mRNA前体
mRNA
单链DNA
cDNA
逆转录酶
转录
剪接
逆转录
复制
启动子
终止子
基因
不含非编码序列。即不含非编码区和内含子
基因组DNA文库与cDNA文库的比较
文库类型 cDNA文库 基因组文库
文库大小
基因中启动子
基因中内含子
基因多少
物种间的基因交流
小
大
无
有
无
有
某种生物的部分基因
某种生物的全部基因
可以
部分基因可以
3.PCR技术（聚合酶链式反应）
在DNA聚合酶作用下，在体外进行DNA大量扩增的一种分子生物学技术
优点：简单、快速、灵敏
应用：医学鉴定、法医鉴定、古生物学研究
（1）原理：
模仿体内DNA复制过程
（2）条件：
模板：
原料：
酶：
引物：
待扩增的DNA分子
4种脱氧核苷三磷酸，即dNTP，N代表A、T、G、C
DNA聚合酶
短的D单链DNA
（3）过程：
（包括多次循环）
①变性
②退火
③延伸
反应过程：模板DNA双链在高温下（90~95 ℃）氢键断裂，解旋成2条DNA单链
温度降低（50~60 ℃）后，2个引物分别与各自互补的DNA单链结合
分别以两条DNA单链为模板，4种脱氧核苷三磷酸为原料，耐高温的Tag DNA聚合酶在适宜的温度（约72℃）下，以引物与模板形成的小段DNA双链区为起点，催化合成一条新的DNA互补链。
思考：
（1）PCR技术中DNA双链解旋的原理与体内DNA复制相同吗？为什么？
（2）PCR扩增的DNA片段大小由什么决定？
（4）产物鉴定的方法
------电泳技术
核酸带负电，其移动速率主要受核酸片段长度的影响。在电场强度一定时，核酸分子越大，向正极移迁速率越慢。
每个条带包含的DNA片段长度是相同的
DNA相对分子质量标准物---作为参照物
亚甲基蓝将DNA染成蓝色
分离、鉴定、纯化核酸和蛋白质的方法
1.实验原理：
活动·PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定
（1）PCR 经过多次循环______、_______、_______三个步骤，可获得大量目的基因或DNA片段。
（2）PCR 技术扩增的酵母细胞中编码核糖体 RNA的DNA部分片段，长度为841 bp，通过______________进行鉴定。
（3）使用__________对凝胶进行染色，再用75%酒精及蒸馏水脱色，观察并分析琼脂糖凝胶中的DNA条带。
变性
退火
延伸
琼脂糖凝胶电泳
亚甲基蓝
PCR仪、微量离心管、微量移液器、一次性吸液枪头
电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）
4种脱氧核苷三磷酸的等量混合液、2种引物
TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水、
电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、
琼脂糖和核酸染料等
琼脂糖凝胶电泳装置
PCR仪
2.材料用具
3.方法步骤
（1）PCR 扩增
①使用___________将PCR体系各成分加入0.2 mL已灭菌的微量离心管中。
②以 3 000 г/min的转速离心____,使反应液集中于微量离心管的底部。
③将微量离心管放入_______中，设置反应条件.扩增后的PCR产物可储存在_______条件下。
微量移液器
30 s
PCR仪
-20 ℃
（2）琼脂糖凝胶电泳
①制备琼脂糖凝胶
②加样
③电泳
（3）染色
（4）观察
结果分析与评价
观察蓝色条带的数目和位置，通过和Marker对比来判断扩增的结果。
模板被污染、引物设计不合理、退火温度过低、DNA聚合酶质量不好等。
除了不加酵母细胞悬液外，其成分和其他微量离心管一样。
3.PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定实验活动的对照组应该如何设计？
1.判断是否成功扩增出DNA片段的依据是什么？
2.如果扩增条带不止一条，可能的原因有哪些？
获
取
目
的
基
因
基因的结构
----原理、条件、过程
方法
活动：PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定
真核基因
原核基因
化学合成法
基因文库
PCR
基因组文库
cDNA文库

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