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2.2.2动物细胞融合技术与单克隆抗体
本节聚焦：
什么是动物细胞融合技术？
单克隆抗体是如何制备的？
在临床上有哪些应用？
靶向药物是指被赋予了靶向（Targeting）能力的药物或其制剂。其目的是使药物或其载体能瞄准特定的病变部位，并在目标部位蓄积或释放有效成分。靶向制剂可以使药物在目标局部形成相对较高的浓度，从而在提高药效的同时抑制毒副作用，减少对正常组织、细胞的伤害。
制备靶向药物的其中一种思路是将抗体等适配体能够与靶标分子特异性结合的探针分子通过化学或物理方法偶联到药物或其载体表面，从而赋予药物或其载体主动与靶标结合的能力
抗体的本质、产生及传统抗体思考：1.抗体的本质是什么？如何产生的？2.用传统的方法如何获取抗体？3.此方法能否快速、大量获取我们想要的某种抗体？为什么？快速、大量制备抗体的方法若要得到大量的单一抗体，我们该如何去做？资料：人们发现，在动物发生免疫反应的过程中，体内的浆细胞可以产生多达百万种以上的特异性抗体，但是每个浆细胞只分泌一种化学性质单一、特异性强的抗体。要想获得大量的单一抗体，必须用克隆单个B淋巴细胞形成细胞群。单克隆抗体存在什么问题？你有什么解决方案？浆细胞不能增殖基因工程与癌细胞融合要获得既能无限增殖又能产生抗体的细胞。一个极富创造力的方案：
1975年，英国科学家米尔斯坦和德国科学家科勒设计实验获得了单克隆抗体。
1984年获得诺贝尔生理学或医学奖。
一个B淋巴细胞 B淋巴细胞群 单克隆抗体
产生
克隆化
培养
单克隆抗体
快速、大量制备抗体的方法
（产量高、纯度高、特异性强）
要实现这一方案，需要解决哪些困难？
细胞融合、筛选、大规模培养
动物细胞融合技术自主探究：（参考教材P48）1.什么是动物细胞融合技术（概念）？原理是什么？2.所形成的杂种细胞有什么特点？3.诱导动物细胞融合的方法有哪些？4.动物细胞融合技术的意义和应用有哪些？动物细胞融合技术
1.原理？
细胞膜的流动性
2.诱导的手段？
灭活病毒、PEG、电融合等
3.融合后细胞的类型？
AA、AB、BB
一
成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。
为单克隆抗体的制备开辟了新途径。
4.应用：
植物体细胞杂交 动物细胞融合
原理
细胞融合前的处理方法
诱导细胞融合的方法
细胞融合成功的标志
主要用途
意义
细胞膜具有一定的流动性、植物细胞的全能性
细胞膜具有一定的流动性
用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁
用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞
电融合法、离心法；聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法
PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法
再生出细胞壁
细胞核的融合
获得完整的杂种植株
主要用于制造单克隆抗体
打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种
突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能
与植物体细胞杂交的比较
动物细胞融合技术
一
阅读P48-49图2-16，思考以下问题：
① 为什么给小鼠注射特定的抗原蛋白？
② 会有几种细胞融合方式（只考虑两个细胞融合）？
③ 杂交瘤细胞是如何筛选出来的？
④ 是否所有的杂交瘤细胞都能产生专一性抗体？
⑤ 有几次筛选过程？目的是什么？
⑥如何大规模进行培养得到大量的单克隆抗体？
单克隆抗体及其应用
二
单克隆抗体的制备过程
单克隆抗体及其应用
注射特定蛋白免疫小鼠
培养小鼠
骨髓瘤细胞
B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
多种细胞
多种杂交瘤细胞
能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
选择培养基筛选
克隆化培养
专一抗体检测
注射到小鼠
腹腔内增殖
体外培养
单克隆抗体
融合
二
用特定的抗原免疫，从小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞。
用特定的选择培养基进行筛选∶在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。
单克隆抗体的制备过程
单克隆抗体及其应用
二
对选择培养的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选，就可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。
将抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞在体外条件下大规模培养，或注射到小鼠腹腔内增殖。
从细胞培养液或小鼠腹水中获取大量的单克隆抗体。
单克隆抗体的制备过程
单克隆抗体及其应用
二
单克隆抗体的制备过程——第一次筛选
单克隆抗体及其应用
二
已知细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤细胞中尽管没有S途径，但能不断分裂增殖。
如何筛选出杂交瘤细胞
培养基中添加氨基嘌呤
AB1、AB2、AB3 ……
专一抗体检验阳性：有限稀释法、抗原-抗体杂交法
单克隆抗体的制备过程——第二次筛选
【原理】将杂交瘤细胞培养液稀释后滴入多孔板，如果稀释度足够高，多孔板的一个孔里就可能只有1个杂交瘤细胞，培养之后(即克隆化培养)，用标记的抗原检测每个小孔上清液里是否含有我们需要的特异性的抗体（抗原抗体能结合即为阳性孔）。这样经过多次克隆化培养以及有限稀释法的筛选，就能选出需要的那种杂交瘤细胞（AB3）。
多孔细胞培养板
抗体检测板
阳性孔
单克隆抗体及其应用
二
【课堂小结】
单克隆抗体
筛选二
杂交细胞
杂交瘤细胞
体外或
体内培养
筛选一
骨髓瘤
细胞
诱导融合
分泌特异抗体
的杂交瘤细胞
杂交瘤细胞群
提取
已免疫的
B淋巴细胞
动物细胞融合技术
动物细胞培养技术
单克隆抗体的制备
既能大量繁殖
又能产生专一抗体
特异性强
灵敏度高
可大量制备
注射
抗原
单克隆抗体的应用
资料1.用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的"早早孕诊断试剂盒"，在妊娠第8天就可以作出诊断，这比原来的诊断方法提前了10 d左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。
单克隆抗体能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备。用于多种疾病的诊断和病原体鉴定。
(1)作为诊断试剂——最广泛应用
单克隆抗体及其应用
二
单克隆抗体的应用
资料2.使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用。抗体—药物偶联物（ADC）通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由抗体、接头和药物（如细胞毒素）三部分组成，它的作用机制如下图所示。
(2)用于治疗疾病和运载药物
单克隆抗体及其应用
二
1.除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？
2.单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？
①可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗；
②一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗。
①检测的特异性和灵敏度大大提高；有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒；
②ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点
单克隆抗体的应用
单克隆抗体及其应用
二
课堂小结
两个过程
动物细胞融合过程
单克隆抗体制备过程
三个“一”
一个诱导细胞融合的新方法
－－灭活病毒
一个新细胞
－－杂交瘤细胞
一个优势
－－单克隆抗体特异性强、灵敏度高、可大量制备的优势
练习与应用
一、概念检测
1.下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的是（ ）
A.它们的原理都涉及细胞膜的流动性
B.都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合
C.融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞
D.前者主要是为了获得细胞产品，后者主要是为了获得杂种植株
2.科学家以SARS病毒的核衣壳蛋白为抗原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确的是（ ）
A. 利用该单克隆抗体可以诊断是否感染SARS病毒
B.体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对SARS病毒的单克隆抗体
C.将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合，经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞
D.将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，从小鼠血清中分离出的抗体为单克隆抗体
C
A
二、拓展应用
假如你掌握了动物细胞融合技术，你想用这种技术来解决哪些问题 解决这些问题的大致思路是怎样的 这样做会有什么风险 请查阅相关资料，完善自己的思路，并形成文字报告，与同学交流。
提示：可以利用动物细胞融合技术培育多倍体胚胎，研究其发育机制，甚至可能培育出新的物种。但是，目前相关技术还不成熟，存在融合率低、胚胎死亡率高等问题，并且还可能带来一些伦理方面的问题。
练习与应用

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