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(共30张PPT)
基因工程
概念
是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫重组DNA技术。
原理
操作环境
操作对象
操作水平
基本过程
目的
优点
基因重组
生物体外
基因
DNA分子水平
剪切→拼接→导入→表达
定向改造生物的遗传性状
定向改造生物体的性状，目的性强
育种周期短，克服远缘杂交不亲和障碍
课本67页
基因工程
概念
是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫重组DNA技术。
基本工具
分子手术刀——限制性内切核酸酶
分子缝合针——DNA连接酶
分子运输车——基因进入受体细胞的载体
分子手术刀——限制性内切核酸酶
来源
分类
作用结果
原核生物中分离提纯
SmaⅠ限制酶
EcoRⅠ限制酶
平末端
黏性末端
在G和C之间
在G和A之间
切割位点
作用部位
特定切点上的磷酸二酯键
特点
专一性
A
T
C
G
T
A
G
C
5’
3’
【重点难点·透析】
限制酶的选择原则
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择Sma Ⅰ。
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择Sma Ⅰ。
(3)确保目的基因和载体出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择PstⅠ和EcoR Ⅰ两种限制酶。
D
1.(2023·江苏盐城调研)图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，AmpR表示氨苄青
霉素抗性基因，neo表示新霉素
抗性基因。下列叙述错误的是
(　　)
A.在构建重组质粒时，可用PstⅠ和HindⅢ切割质粒和外源DNA
B.在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因
C.若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反向连接
D.导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长
分子缝合针——DNA连接酶
作用
将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，形成重组DNA分子。
作用部位
磷酸二酯键
类型 来源 功能
E·coli DNA连接酶
T4 DNA连接酶
大肠杆菌
T4噬菌体
只能连接黏性末端
能连接黏性末端和
平末端(效率较低)
DNA连接酶 DNA聚合酶
相同点 作用实质 化学本质 不 同 点 模板
作用对象
作用结果
用途
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质
不需要
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
形成DNA的一条链
基因工程
DNA复制
只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
DNA连接酶与DNA聚合酶的区别：
1.根据所学知识，完成以下填空：
①限制酶 ②解旋酶 ③DNA连接酶 ④DNA聚合酶 ⑤RNA聚合酶
b
a
A.切断a处的酶为_______
B.连接a处的酶为_______
C.切断b处的酶为_______
①
③④⑤
②
a：磷酸二酯键；b：氢键
分子运输车——基因进入受体细胞的载体
种类
质粒
噬菌体
动植物病毒
一种裸露的、结构简单、独立于细胞核或拟核外的并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
作用
将目的基因（外源DNA片段）转移（导入）到受体细胞中去
特点
②能够在宿主细胞中稳定保存和自我复制；
①具有一个或多个限制酶切位点，便于外源基因插入；
③具有标记基因，便于重组DNA的鉴定和筛选；
④对受体细胞无害；
标记基因的作用
标记基因可用于检测目的基因是否导入受体细胞：
【重点难点·透析】
2.(2021·全国乙卷，38)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。
回答下列问题：
(1)常用的DNA连接酶有E.coliDNA连接酶和T4 DNA连接酶。上图中_________________酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接。上图中_______________________________________酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。
EcoR Ⅰ、
Pst Ⅰ
EcoR Ⅰ、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcoR Ⅴ
(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是________
______。
(3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能________；质粒DNA分子上有________________，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是_____________________________________________________________________。
(4)表达载体含有启动子，启动子是指_____________________________________
____________。
磷酸二
酯键
自我复制
限制酶切割位点
用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞
RNA聚合酶识别、结合和驱动转录的一
段DNA序列
基因工程
概念
是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。
基本工具
分子手术刀——限制性内切核酸酶
分子缝合针——DNA连接酶
分子运输车——基因进入受体细胞的载体
操作程序
目的基因的筛选和获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测和鉴定
前提
核心
关键
保证
目的基因的筛选和获取
目的基因
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
目的基因获取途径
从已知结构和功能清晰的基因中获取
PCR扩增目的基因
原理
DNA半保留复制
概念
在体外提供DNA复制的各种组分与反应条件对目的基因进行大量复制的技术
原料
DNA母链
4种脱氧核苷酸
耐高温的DNA聚合酶
引物
一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸;使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
目的基因的筛选和获取
目的基因获取途径
从已知结构和功能清晰的基因中获取
PCR扩增目的基因
原理
DNA半保留复制
概念
在体外提供DNA复制的各种组分与反应条件对目的基因进行大量复制的技术
原料
DNA母链
4种脱氧核苷酸
耐高温的DNA聚合酶
引物
过程
变性
复性
延伸
温度超过90℃时，DNA双链氢键断裂形成单链
温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条DNA单链结合
温度上升到72℃左右，四种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链
目的基因的筛选和获取
目的基因获取途径
从已知结构和功能清晰的基因中获取
PCR扩增目的基因
原理
DNA半保留复制
概念
在体外提供DNA复制的各种组分与反应条件对目的基因进行大量复制的技术
原料
DNA母链
4种脱氧核苷酸
耐高温的DNA聚合酶
引物
过程
变性
复性
延伸
结果
呈指数形式增长
鉴定
采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定产物
①在PCR过程中实际加入的原料为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。
②引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，作为新子链的合成起点，只能结合在母链的3′端，使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。
③复性温度过高，则引物难以与模板链结合，温度过低则易使两条母链配对结合，均无法获得PCR产物。
④真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。　　　
名师解读
选择性必修三课本77页
基因表达载体的构建
同种限制酶或产生相同黏性末端的限制酶切割
DNA
连接酶
目的基因
限制酶切割位点
获取目的基因
限制酶切割位点
质粒
重组
DNA分子
限制酶
限制酶
过程
标记基因
复制原点
启动子
终止子
目的基因
位置：基因的上游
功能：是RNA聚合酶识别和结合的部位，具有驱动基因转录的作用。
位置：基因下游
作用：使转录在所需的地方停止下来。
能够在受体细胞中自我复制或整合到受体DNA上
注意：
1.基因表达载体构建过程中不能破坏启动子、终止子、复制原点、标记基因等。
2.目的基因必须插入启动子和终止子之间。
结果
本质 作用
启动子
终止子
起始密码子
终止密码子
启动子与终止子，起始密码子和终止密码子
一段DNA
一段DNA
mRNA上三个相邻的碱基
mRNA上三个相邻的碱基
RNA聚合酶识别和结合位点，启动转录
决定转录的结束
决定翻译的开始
决定翻译的结束
将目的基因导入受体细胞
受体细胞 导入方法
植物细胞
动物细胞
原核细胞
花粉管通道法
农杆菌转化法
显微注射技术
Ga+处理法
花粉管通道法
②在植物授粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。
①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；
操作
特点
①利用植物授粉后形成的天然花粉管通道，将外源基因携带进入胚囊，此时的受精卵未形成细胞壁，且正在进行活跃的DNA复制，容易将外源DNA片段整合到受体基因组中。
②操作简单、技术成本低，免去了组织培养以及诱导再生植株的全套人工培养过程。
农杆菌转化法
农杆菌的特点
农杆菌生活在土壤中的微生物，自然条件下可侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。
农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
T-DNA
目的基因
含目的基因的重组Ti质粒
含重组Ti质粒的农杆菌
植物细胞
将目的基因插入染色体DNA中
表现出新性状的植物
(2)农杆菌转化法中的两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T DNA导入受体细胞。　　
T-DNA
目的基因
含目的基因的重组Ti质粒
含重组Ti质粒的农杆菌
植物细胞
将目的基因插入染色体DNA中
表现出新性状的植物
显微注射技术
Ga+处理法
①受体细胞：常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌最广泛。
优点：繁殖快、单细胞、遗传物质相对较少、易于培养。
② Ca2+处理法（感受态细胞法）的一般过程
Ca2+处理大肠杆菌
使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
Ca2+的作用：增加细胞的通透性
这种细胞称为感受态细胞
一般利用温度变化导入
将重组的基因表达载体导入其中
目的基因的检测和鉴定
检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因
检测目的基因是否转录出了mRNA
检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
PCR扩增
DNA分子杂交技术
抗原—抗体
杂交技术
分子水平的检测
个体水平的鉴定
PCR扩增
RNA分子杂交技术
2.(2022·全国乙卷，38)新冠疫情出现后，病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。回答下列问题：
(1)新冠病毒是一种RNA病毒，检测新冠病毒RNA(核酸检测)可以采取RT—PCR法。这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是________________________，再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。
(2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的_____________________来进行。PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是______________。
逆转录酶(或反转录酶)　
特异性核苷酸序列
复性(或退火)
(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测(检测体内是否有新冠病毒抗体)，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明________________________(答出1种情况即可)；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明__________________________。
(4)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S(具有抗原性)的编码序列(目的基因)。为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是____________________________________________________________________。
曾感染新冠病毒，已康复
已感染新冠病毒，是患者
获取目的基因→构建基因表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定

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