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第三章 基因工程 知识清单
第1节　重组DNA技术的基本工具
一、重组DNA技术的基本工具
1.基因工程的概念
别名 重组DNA技术
操作环境 生物体外
操作对象 基因
操作水平 DNA分子水平
结果 创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品
2.基因工程的诞生和发展
(1)肺炎链球菌转化实验不仅证明DNA是遗传物质，还证明了DNA可在同种生物不同个体之间转移。
(2)DNA双螺旋结构的提出和半保留复制的证明。
(3)中心法则的确立。
(4)遗传密码的破译。
(5)基因转移载体和限制酶、DN连接酶和逆转录酶的发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。
(6)DNA体外重组的实现。
(7)重组DNA表达实验的成功。
(8)DNA测序和合成技术的发明。
(9)PCR技术的发明。
(10)基因组编辑技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。
3.重组DNA技术的基本工具
(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)—“分子手术刀”
来源 种类 特点（专一性） 作用 结果
主要来自原核生物 分离的限制酶有数千种 1.识别双链DNA分子的特定核苷酸序列 2.使每一条连中特定部位的磷酸二酯键断开 断开两个核苷酸之间的磷酸二酯键 产生黏性末端和平末端
● 已知限制酶EcoR Ⅰ和Sma Ⅰ识别的碱基序列和酶切位点分别为G↓AATTC和CCC↓GGG，在图中写出两种限制酶切割DNA后产生的末端并写出末端的种类。
EcoR Ⅰ限制酶和Sma Ⅰ限制酶识别的碱基序列不同，切割位点不同(填“相同”或“不同”)，说明限制酶具有专一性。
(2)DNA连接酶—“分子缝合针”
①作用：
DNA连接酶能够将DNA片段连接起来。
②分类：
基因工程常用的DNA连接酶有两种：
● E.coli DNA连接酶：连接互补的黏性末端，不能连接平末端。
● T4 DNA连接酶：连接互补的黏性末端和平末端。
(3)载体——“分子运输车”
①基因工程通常利用质粒作为载体将基因送入细胞。质粒是独立于细胞核或拟核DNA之外，具有自我复制能力的环状DNA分子。
● 质粒DNA分子上有一个或多个限制酶切割位点，可供外源基因插入其中。
● 携带外援DNA片段的质粒进入受体细胞后，能够在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA的同步复制。
质粒上常有特殊的标记基因，如抗性基因，便于重组DNA分子的筛选。
②基因工程常用的载体除质粒外，还有噬菌体、动物病毒等。
二、DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定
1.DNA的粗提取与鉴定实验原理
(1)DNA不溶于酒精，蛋白质溶于酒精。
(2)DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于2_mol/L的NaCl溶液。
(3)在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
2．PCR实验原理
PCR利用了DNA的热变性原理和DNA半保留复制的原理。
3.DNA片段电泳鉴定的原理
DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
● 在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
● 凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
4．实验步骤
1.DNA的粗提取与鉴定具体过程
①称取30 g洋葱，切碎，加入10 mL研磨液，充分研磨。
↓
②漏斗中垫纱布，将研磨液过滤到烧杯中，4 ℃处理，取上清液。
↓
③在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液，静置2～3 min，用玻璃棒沿同一方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去水分。
↓
④取两支20 ml的试管编号A、B，各加入2 mol/L的NaCl溶液5 mL，将丝状物溶于B试管的NaCl溶液中。然后向两支试管中各加入4 mL的二苯胺试剂。混匀后，将试管置于沸水中加热5 min。
↓
⑤结果观察：A试管不变蓝，B试管变蓝色。
第2节 基因工程的基本操作程序
1.目的基因的筛选与获取
(1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
(2)筛选合适的目的基因
①从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
②利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。
(3)目的基因的获取
①人工合成目的基因。
②PCR获取和扩增目的基因
a.PCR(聚合酶链式反应)：是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
b.PCR反应的条件：一定的缓冲溶液、DNA模板、2种引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶，以及能自动调控温度的仪器。
c.PCR扩增的过程
● 变性：温度上升到90 ℃以上，目的基因DNA受热变性后解为单链。
● 复性：温度下降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
● 延伸：温度上升到72 ℃左右时，溶液中四种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下加到引物的3′端合成子链。
● 重复循环多次。
d.PCR产物的鉴定：常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
③通过构建基因文库来获取目的基因。
2.基因表达载体的构建——基因工程的核心
(1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
(2)基因表达载体的组成
(3)构建过程
首先用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口，然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割目的基因的DNA片段，再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处。
3.将目的基因导入受体细胞
1.导入植物细胞
常用方法：花粉管通道法、农杆菌转化法（适用于双子叶植物或裸子植物）。
2.导入动物细胞
①常用方法：显微注射技术。
②常用受体细胞：受精卵。
3.导入微生物细胞
①方法：用Ca+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。
②受体细胞：原核生物（使用最广泛的是大肠杆菌）。
③原核生物的特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。
4.目的基因的检测与鉴定
检测水平 检测方法
分子水平检测 通过PCR等技术检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因，检测目的基因是否转录出了mRNA.
检测目的基因是否翻译出蛋白质，采用抗原—抗体杂交法.
个体生物学水平鉴定 如做抗虫或抗病接种实验等
第3节 基因工程的应用
一、基因工程在农牧业方面的应用
1.基因作物方面
化学杀虫剂的施用量减少，作物产量增加，经济效益增加。
（1）转基因抗虫植物
①措施：从某些生物中分离出具有抗虫功能的基因，将它导入作物中培育出具有抗虫性的作物。
②成果：转基因抗虫棉花、玉米、大豆、水稻和马铃薯等。
（2）转基因抗病植物
①措施：将来源于某些病毒、真菌等的抗病基因导入植物中，培育出转基因抗病植物。
②成果：转基因抗病毒甜椒、番木瓜和烟草等。
（3）转基因抗除草剂植物
①措施：将降解或抵抗某种除草剂的基因导入作物，培育出抗除草剂的作物品种。
②成果：转基因抗除草剂玉米、大豆、油菜和甜菜等。
（4）改良植物的品质
①目的：改良植物的营养价值、观赏价值等。
②成果：将某种必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因导入植物中，可以提高这种氨基酸的含量。
2.转基因动物方面
有些成果正在进入实用化和商业化开发的阶段。
（1）提高动物的生长速率
①措施：将外源生长激素基因导入动物体内，以提高动物的生长速率。
②成果：转基因鲤鱼。
（2）改善畜产品的品质
①存在问题：有些人由于乳糖酶分泌少，不能完全消化牛奶中的乳糖，食用牛奶后会出现腹泻等不适症状，称之为乳糖不耐受。
②措施：将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组，使获得的转基因牛分泌的乳汁中，乳糖的含量大大降低，而其他成分不受影响。
二、基因工程在医药卫生领域的应用
1.对微生物或动植物的细胞进行基因改造
（1）目的：使它们能够生产药物。
（2）药物种类：细胞因子、抗体、疫苗和激素等。
2.让哺乳动物批量生产药物——乳腺生物反应器或乳房生物反应器
（1）措施：将药用蛋白基因与乳腺中特异性表达的基因的启动子等调控元件重组在一起。
（2）受体细胞：动物的受精卵。
（3）导入方法：显微注射法。
3.建立移植器官工厂
在器官供体的基因组中导入某种调节因子，以抑制抗原决定基因的表达，或设法除去抗原决定基因，再结合克隆技术，培育出不会引起免疫排斥反应的转基因克隆动物器官。
三、基因工程在食品工业方面的应用
1.成果：生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等。
2.实例： 将编码牛凝乳酶的基因导入大肠杆菌、黑曲霉或酵母菌的基因组中，再通过工业发酵批量生产凝乳酶。
第4节 蛋白质工程的崛起
一、蛋白质工程的概念
1.蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。
基础：蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。
2.操作方法及对象：改造或合成基因。
3.目的：改造现有蛋白质或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。
4.结果：改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质。
5.蛋白质工程的实质：是对编码蛋白质的基因进行改造。蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。
6.相关学科及技术：分子生物学、晶体学和计算机技术。
二、蛋白质工程崛起的缘由
基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质，这些天然蛋白质的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。
三、蛋白质工程与基因工程的异同
项目 蛋白质工程 基因工程
过程 从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质 目的基因的筛选与获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
实质 定向改造或生产人类所需要的蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品
结果 可生产自然界中不存在的蛋白质 只能生产自然界中已存在的蛋白质
联系 蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程
三、蛋白质工程的应用
(1)在医药方面
①利用蛋白质工程研发药物。
②实例：如果将干扰素分子上的一个半胱氨酸变成丝氨酸，在一定条件下，可以延长保存时间。
(2)在工业方面
①蛋白质工程被广泛用于改进酶的性能或开发新的工业用酶。
②实例：枯草杆菌蛋白酶具有水解蛋白质的作用，因此常被用于洗涤剂工业、丝绸工业等。
(3)在农业方面
科学家正在尝试改造某些参与调控光合作用的酶，以提高植物光合作用的效率，增加粮食的产量。第三章 基因工程 知识清单
第1节　重组DNA技术的基本工具
一、重组DNA技术的基本工具
1.基因工程的概念
别名 技术
操作环境 生物体外
操作对象
操作水平 水平
结果 创造出更符合人们需要的新的 和
2.基因工程的诞生和发展
(1)肺炎链球菌转化实验不仅证明DNA是遗传物质，还证明了DNA可在同种生物不同个体之间 。
(2)DNA双螺旋结构的提出和 的证明。
(3)中心法则的确立。
(4) 的破译。
(5)基因转移载体和 的发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。
(6) 体外重组的实现。
(7)重组DNA表达实验的成功。
(8)DNA测序和合成技术的发明。
(9) 技术的发明。
(10) 技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。
3.重组DNA技术的基本工具
(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)—“分子手术刀”
来源 种类 特点（专一性） 作用 结果
主要来 自 分离的限制酶有 种 1.识别双链DNA分子的 2.使每一条连中特定部位的磷酸二酯键断开 断开两个核苷酸之间的 产生 和平末端
● 已知限制酶EcoR Ⅰ和Sma Ⅰ识别的碱基序列和酶切位点分别为G↓AATTC和CCC↓GGG，在图中写出两种限制酶切割DNA后产生的末端并写出末端的种类。
EcoR Ⅰ限制酶和Sma Ⅰ限制酶识别的 不同，切割位点 (填“相同”或“不同”)，说明限制酶具有 。
(2)DNA连接酶—“分子缝合针”
①作用：
能够将DNA片段连接起来。
②分类：
基因工程常用的 有两种：
● E.coli DNA连接酶：连接互补的 ，不能连接平末端。
● T4 DNA连接酶：连接互补的 。
(3)载体——“分子运输车”
①基因工程通常利用 作为载体将基因送入细胞。 是独立于细胞核或拟核DNA之外，具有自我复制能力的 。
● 质粒DNA分子上有 ，可供外源基因插入其中。
● 携带外援DNA片段的质粒进入受体细胞后，能够在细胞中进行 ，或整合到受体DNA上，随受体DNA的同步复制。
质粒上常有特殊的 ，如抗性基因，便于 。
②基因工程常用的载体除质粒外，还有 等。
二、DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定
1.DNA的粗提取与鉴定实验原理
(1) 不溶于酒精， 溶于酒精。
(2)DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于 溶液。
(3)在一定温度下，DNA遇 试剂会呈现蓝色。
2．PCR实验原理
PCR利用了 和 的原理。
3.DNA片段电泳鉴定的原理
DNA分子具有 ，在一定的 下，这些基团可以带上 ，在电场的作用下，这些带电分子会向着 的电极移动，这个过程就是电泳。
● 在凝胶中DNA分子的迁移速率与 、 和 等有关。
● 凝胶中的DNA分子通过 ，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
4．实验步骤
1.DNA的粗提取与鉴定具体过程
①称取30 g洋葱，切碎，加入10 mL研磨液，充分研磨。
↓
②漏斗中垫 ，将研磨液过滤到烧杯中， ℃处理，取上清液。
↓
③在上清液中加入体积相等的、预冷的 溶液，静置2～3 min，用玻璃棒沿同一方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去水分。
↓
④取两支20 ml的试管编号A、B，各加入2 mol/L的NaCl溶液5 mL，将丝状物溶于B试管的NaCl溶液中。然后向两支试管中各加入4 mL的 。混匀后，将试管置于 中加热5 min。
↓
⑤结果观察：A试管 ，B试管 。
第2节 基因工程的基本操作程序
1.目的基因的筛选与获取
(1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞 或获得预期 等的基因。
(2)筛选合适的目的基因
①从相关的已知 的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
②利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。
(3)目的基因的获取
①人工合成目的基因。
②PCR 和扩增目的基因
a.PCR(聚合酶链式反应)：是一项根据 的原理，在体外提供参与DNA复制的各种 反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行 的技术。
b.PCR反应的条件：一定的 、DNA模板、2种 、4种 、 DNA聚合酶，以及能自动调控温度的仪器。
c.PCR扩增的过程
● 变性：温度上升到90 ℃以上，目的基因DNA 。
● 复性：温度下降到50 ℃左右时， 通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
● 延伸：温度上升到72 ℃左右时，溶液中 在耐高温的 的作用下加到引物的 端合成子链。
● 重复循环多次。
d.PCR产物的鉴定：常采用 来鉴定。
③通过构建 来获取目的基因。
2.基因表达载体的构建——基因工程的核心
(1)目的：使目的基因 ，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
(2)基因表达载体的组成
(3)构建过程
首先用一定的 切割载体，使它出现一个切口，然后用 限制酶或 的限制酶切割目的基因的DNA片段，再利用 将目的基因片段拼接到载体的切口处。
3.将目的基因导入受体细胞
1.导入植物细胞
常用方法：花粉管通道法、 （适用于双子叶植物或裸子植物）。
2.导入动物细胞
①常用方法： 。
②常用受体细胞： 。
3.导入微生物细胞
①方法：用 处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。
②受体细胞： （使用最广泛的是大肠杆菌）。
③原核生物的特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。
4.目的基因的检测与鉴定
检测水平 检测方法
分子水平检测 通过 等技术检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因，检测目的基因是否转录出了 .
检测目的基因是否翻译出蛋白质，采用 .
个体生物学水平鉴定 如做抗虫或抗病接种实验等
第3节 基因工程的应用
一、基因工程在农牧业方面的应用
1.基因作物方面
化学杀虫剂的施用量 ，作物产量 ，经济效益 。
（1）转基因抗虫植物
①措施：从某些生物中分离出具有 功能的基因，将它导入作物中培育出具有抗虫性的作物。
②成果：转基因抗虫棉花、玉米、大豆、水稻和马铃薯等。
（2）转基因抗病植物
①措施：将来源于某些病毒、真菌等的 基因导入植物中，培育出转基因抗病植物。
②成果：转基因抗病毒甜椒、番木瓜和烟草等。
（3）转基因抗除草剂植物
①措施：将 的基因导入作物，培育出抗除草剂的作物品种。
②成果：转基因抗除草剂玉米、大豆、油菜和甜菜等。
（4）改良植物的品质
①目的：改良植物的 等。
②成果：将某种必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因导入植物中，可以提高这种氨基酸的含量。
2.转基因动物方面
有些成果正在进入 开发的阶段。
（1）提高动物的生长速率
①措施：将 基因导入动物体内，以提高动物的生长速率。
②成果：转基因鲤鱼。
（2）改善畜产品的品质
①存在问题：有些人由于 分泌少，不能完全消化牛奶中的乳糖，食用牛奶后会出现腹泻等不适症状，称之为乳糖不耐受。
②措施：将 基因导入奶牛基因组，使获得的转基因牛分泌的乳汁中， 的含量大大降低，而其他成分不受影响。
二、基因工程在医药卫生领域的应用
1.对微生物或动植物的细胞进行基因改造
（1）目的：使它们能够生产药物。
（2）药物种类：细胞因子、抗体、疫苗和激素等。
2.让哺乳动物批量生产药物——乳腺生物反应器或乳房生物反应器
（1）措施：将药用蛋白基因与乳腺中 等调控元件重组在一起。
（2）受体细胞：动物的 。
（3）导入方法： 。
3.建立移植器官工厂
在器官供体的基因组中导入某种调节因子，以抑制 的表达，或设法除去 ，再结合克隆技术，培育出不会引起免疫排斥反应的转基因克隆动物器官。
三、基因工程在食品工业方面的应用
1.成果：生产 、 等。
2.实例： 将编码牛凝乳酶的基因导入大肠杆菌、黑曲霉或酵母菌的基因组中，再通
过 批量生产凝乳酶。
第4节 蛋白质工程的崛起
一、蛋白质工程的概念
1.蛋白质工程是指以蛋白质分子的 及其与 的关系作为基础，通过 ，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。
基础：蛋白质分子的 及其与 的关系。
2.操作方法及对象： 。
3.目的：改造现有蛋白质或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。
4.结果：改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质。
5.蛋白质工程的实质：是对编码蛋白质的基因进行改造。蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的 。
6.相关学科及技术：分子生物学、晶体学和计算机技术。
二、蛋白质工程崛起的缘由
基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质，这些天然蛋白质的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合 的需要。
三、蛋白质工程与基因工程的异同
项目 蛋白质工程 基因工程
过程 从预期的蛋白质功能出发→设计预期的 →推测应有的 →找到并改变相对应的 (基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质 目的基因的筛选与获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
实质 定向改造或生产人类所需要的蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品
结果 可生产 只能生产
联系 蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程
三、蛋白质工程的应用
(1)在医药方面
①利用蛋白质工程研发 。
②实例：如果将干扰素分子上的一个半胱氨酸变成 ，在一定条件下，可以延长保存时间。
(2)在工业方面
①蛋白质工程被广泛用于改进 或开发新的工业用酶。
②实例：枯草杆菌蛋白酶具有水解蛋白质的作用，因此常被用于洗涤剂工业、丝绸工业等。
(3)在农业方面
科学家正在尝试改造某些参与调控 的酶，以提高植物光合作用的效率，增加粮食的产量。

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