资源简介

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2.1.1植物细胞工程的基本技术
目录
壹
植物组织培养技术
贰
植物体细胞杂交技术
CONTENTS
操作水平
细胞工程（cell engineering)是指应用细胞生物学、分子生物学和发育生物学等学科的原理和方法，通过细胞、细胞器或组织水平上的操作，有目的地获得特定的细胞或组织、器官、个体或其产品的一门综合性的生物工程。
原理和方法
目的
动物细胞工程
植物细胞工程
植物组织培养
植物体细胞杂交
1902年，哈伯兰特，提出细胞全能性的理论。
1958年，斯图尔德，发现胡萝卜的体细胞可分化为胚，为细胞全能性理论提供了强有力的支持。
1960年，科金，用真菌的纤维素酶分解番茄根的细胞壁，成功获得了原生质体。
1964年，古哈，在培养毛曼陀罗的花药时，首次得到了由花药中的花粉粒发育而来的胚。
1971年，卡尔森，诱导烟草种间原生质体融合，获得了第一株体细胞种间杂种植株。
1974年，土壤农杆菌的Ti质粒发现。之后，该质粒应用于植物分子生物学领域，促进了植物细胞工程与分子生物学技术的紧密结合。
植物细胞工程的发展历程
1975年，米尔斯坦和科勒，创立单克隆抗体技术
1890年，希普，世界上首例胚胎移植成功
1907年，哈里森，
首创了动物组织体外培养法
1951年，张明觉，
发现哺乳动物精子获能现象
1958年，格登，体细胞核移植成功
1959年，试管家兔诞生
1978年，胚胎分割移植工程
1981年，埃文斯，
分离和培养小鼠胚胎干细胞
1996年，克隆羊诞生
2006年，山中伸弥，
获得诱导多能干细胞
2014年，单细胞基因组测序进行遗传病筛查的试管婴儿诞生
动物细胞工程的发展历程
从社会中来
“其茅葺，其叶青青，犹绿衣郎，挺节独立，可敬可慕。迨（dài）夫开也，凝情瀼（ráng）露，万态千妍，薰风自来，四坐芬郁，岂非入兰室乎！岂非有国香乎”这是我国历史上第一部兰谱——《金漳兰谱》（宋·赵时庚）中对兰花的一段描述。
从古至今，我国人民都把兰花看作高洁、典雅的象征，很多人喜欢养兰花。但是，兰花种子通常发育不全，在自然条件下萌发率极低；传统分株繁殖的方法又存在繁殖周期长、繁殖率低等问题，如果靠自然繁殖，兰花的价格可想而知了。如何能让名贵的兰花大量、快速地繁殖，从而走入寻常百姓家呢？
植物组织培养技术
植物组织培养技术
全能性：细胞经过分裂和分化后，仍然具有产生完整生物体或分化成其他各种细胞的潜能。
实例：
胡萝卜韧皮部细胞发育成完整植株
受精卵发育成个体（动植物）
蜜蜂受精卵发育成工蜂，卵细胞发育成雄峰
用一片叶子、一片花瓣、一粒花粉繁殖出新的植株
韧皮部细胞
细胞团块
根或芽
幼苗
胡萝卜植株
叶子
花粉
花瓣
细胞
体现细胞全能性的原因：生物体的每个细胞中都含有发育成为完整个体所需的全部遗传物质。
①不体现全能性的实例：
②不体现全能性的原因：基因在特定时间、空间条件下选择性表达
芽原基的细胞只能发育为芽
叶原基的细胞只能发育为叶
植物细胞表现出全能性的条件：①离体；②一定的营养物质、植物激素；③适宜的温度、pH、光照、无菌等外界条件
植物组织培养技术
生长点
叶原基
芽轴
芽原基
枝芽结构示意图
叶原基的细胞只能发育为叶
芽原基的细胞只能发育为芽
在特定的时间和空间条件下，细胞中的基因会选择性表达
植物组织培养技术
植物组织培养(plant tissue culture)是指将离体的植物器官、组织或细胞等，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其形成完整植株的技术。
植物组织培养技术
接种外植体
诱导愈伤组织
诱导生芽
诱导生根
移栽成活
植物组织培养技术
接种外植体
诱导愈伤组织
诱导生芽
诱导生根
移栽成活
脱分化
再分化
再分化
外植体
脱分化
愈伤组织
再分化
芽、根
试管苗
移栽
完整植株
探究·实践--菊花的组织培养
实验原理
外植体
愈伤组织
芽、根
脱分化
再分化
生长发育
植物细胞一般具有全能性
脱分化
再分化
让已经分化的细胞，经过诱导后，失去其特有的结构和功能而转变成未分化的细胞的过程。
排列疏松无而无规则，是一种高度液泡化的，呈无定形状的薄壁细胞。
愈伤组织
愈伤组织在培养过程中重新分化根或芽等器官的过程。
探究·实践--菊花的组织培养
直接途径
间接途径
外植体
胚状体
幼苗
外植体
胚状体
幼苗
愈伤组织
胡萝卜根韧皮部的细胞
愈伤组织
胚状体
幼苗
胡萝卜
胚状体：离体培养条件下，没有经过受精过程，但是经过了胚胎发育过程所形成的胚状类似物，因而统称为体细胞胚或胚状体。
胚状体途径
探究·实践--菊花的组织培养
Ⅰ. 用酒精擦拭双手和超净工作台台面
Ⅱ. 外植体的消毒
①消毒
流水 冲洗
→酒精消毒30s
→无菌水清洗2～3次
→次氯酸钠溶液处理30min
→无菌水清洗2～3次
探究·实践--菊花的组织培养
将消过毒的外植体置于无菌培养皿中
→用无菌滤纸吸去表面的水分
→用解剖刀将外植体切成0.5～1cm长的小段。
②外植体的切段
防止杂菌生长：
①杂菌与培养物竞争（种间竞争）营养；
②产生有害物质危害培养物。
在酒精灯火焰旁，将外植体的1/3～1/2插入诱导愈伤组织的培养基中。用封口膜或瓶盖封盖瓶口，并在培养瓶上作好标记。
③接种外植体
探究·实践--菊花的组织培养
注意：接种时注意外植体的方向，不要倒插。（形态学上端朝上，下端朝下）
探究·实践--菊花的组织培养
④诱导愈伤组织
将接种了外植体的锥形瓶或植物组织培养瓶置于18～22℃的培养箱中培养。在培养过程中，定期观察和记录愈伤组织的生长情况。（脱分化）
注意：该过程一般不需要光照。有光易形成维管组织，不易形成愈伤组织。
探究·实践--菊花的组织培养
高细胞分裂素/
低生长素
细胞分裂素与
生长素比例适宜
高生长素/
低细胞分裂素
产生愈伤组织
产生不定根
产生不定芽
探究·实践--菊花的组织培养
培养15～20d后，将生长良好的愈伤组织转接到诱导生芽的培养基上。长出芽后，再将其转接到诱导生根的培养基上，进一步诱导形成试管苗。 （再分化）
⑤诱导生芽生根
注意：每日需要给予适当时间和强度的光照。（光照培养，促进叶绿素合成）
探究·实践--菊花的组织培养
移栽前先打开封口膜或瓶盖，让试管苗在培养箱内生长几日。用流水清洗掉根部的培养基后，将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境中，待其长壮后再移栽入土。每天观察并记录幼苗的生长情况，适时浇水、施肥，直至开花。
⑥移栽
探究·实践--菊花的组织培养
根、芽
植物体
再分化
培养条件：①无菌②营养物质③适宜条件（温度、PH、光等）
④植物激素：
遮光
光照
芽发育成叶，叶肉细胞中叶绿素的合成需要光照
脱分化
愈伤组织
离体的植物器官、组织或细胞（外植体）
愈伤组织重新分化为芽、根等器官
失去特有结构和功能转变成未分化的细胞
生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键。生长素和细胞分裂素的比例和浓度会影响植物细胞的发育方向。
如：胡萝卜的形成层、菊花幼茎段、月季的花药…
排列不规则，高度液泡化，呈不定型状态的薄壁细胞
植物体细胞杂交技术
欲培育地上长番茄和地下结马铃薯的“超级作物”。你有什么好妙招？
利用传统有性杂交方法能实现吗？为什么？
不能。因为不同种生物之间存在着生殖隔离
植物体细胞杂交技术
酶解法原理：植物细胞的细胞壁主要由纤维素和果胶构成；酶具有专一性
（1）去除细胞壁
去壁原因：细胞壁阻碍着细胞间的杂交（阻碍了原生质体间的融合）
方法：酶解法
原生质体
植物体细胞杂交技术
②方法：
物理法：电融合法、离心法等
化学法：聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法等
①原理：细胞膜具有一定的的流动性
（2）原生质体间的融合
注意：去除细胞壁和诱导原生质体融合时，不能在低渗溶液中进行。将细胞放在等渗或略大于的溶液中，防止原生质体吸水而涨破，保持原生质体正常。
植物体细胞杂交技术
A细胞
B细胞
去壁
B原生质体
A原生质体
正在融合的原生质体
原生质体融合
脱分化
杂种细胞AB
愈伤组织
再生壁
再分化
再生出小植株
杂种植株AB
植物细胞融合技术
植物组织培养技术
去壁
体现了细胞膜的流动性
体现了植物细胞的全能性
融合完成的标志
植物体细胞杂交技术
在此基础上，科学家们利用植物体细胞杂交技术，又相继培育出了白菜—甘蓝、普通小麦—长穗偃麦草等杂种。我国科学家还在木本植物的体细胞杂交方面培育出了多种柑橘属不同种间的杂种植株。
白菜
甘蓝
白菜—甘蓝
植物组织培养和植物体细胞杂交的异同点
植物组织培养 植物体细胞杂交技术
生殖方式
原理
步骤
意义
联系 植物体细胞杂交技术包括 和 两个过程，植物组织培养是植物体细胞杂交的一个环节，融合的体细胞只有通过植物组织培养才能发育成完整的个体。
无性繁殖
细胞全能性
①脱分化
②再分化
保持优良性状，繁殖速度快
打破生殖隔离，实现远缘杂交育种
①去除细胞壁
②融合形成杂种细胞
③组织培养（脱分化、再分化）
细胞膜具有一定的流动性、植物细胞的全能性
无性繁殖
植物细胞融合
植物组织培养
课堂小结
脱分化
再分化
原理
过程
花药离体培养
细胞全能性
操作步骤
外植体
根、芽、胚状体
愈伤组织
外植体消毒
接种
切块
形成愈伤组织
诱导生芽生根
植物组织培养
植物细胞工程
植物体细胞杂交
变异类型
原理
育种类型
概念
植物细胞融合
原生质体制备
过程
植物组织培养
原生质体融合
优缺点
1.植物组织培养技术常用于商业化生产，其过程一般为：无菌培养物的建立→培养物增殖→生根培养→试管苗移栽及鉴定。下列相关叙述错误的是( )
A.为获得无菌培养物，外植体要消毒处理后才可接种培养
B.组织培养过程中也可无明显愈伤组织形成，直接形成胚状体等结构
C.提高培养基中生长素和细胞分裂素的比值，有利于诱导生根
D.用同一植株体细胞离体培养获得的再生苗不会出现变异
随堂检测
1.植物组织培养技术常用于商业化生产，其过程一般为：无菌培养物的建立→培养物增殖→生根培养→试管苗移栽及鉴定。下列相关叙述错误的是( )
A.为获得无菌培养物，外植体要消毒处理后才可接种培养
B.组织培养过程中也可无明显愈伤组织形成，直接形成胚状体等结构
C.提高培养基中生长素和细胞分裂素的比值，有利于诱导生根
D.用同一植株体细胞离体培养获得的再生苗不会出现变异
答案：D
解析：植物组织培养过程中应注意无菌操作，为获得无菌培养物，外植体要经过表面消毒处理后，才能进行培养，所用的培养基必须彻底灭菌；组织培养过程中也可无明显愈伤组织形成，直接形成胚状体等结构，胚状体若包裹上人工种皮，可制作成人工种子；生长素和细胞分裂素的比值高时，有利于根的分化、抑制芽的形成，因此提高培养基中生长素和细胞分裂素的比值，有利于诱导生根；用同一植株体细胞离体培养获得的再生苗会出现变异，如在愈伤组织的培养过程中可能发生基因突变等变异；故选D。
1.植物组织培养技术常用于商业化生产，其过程一般为：无菌培养物的建立→培养物增殖→生根培养→试管苗移栽及鉴定。下列相关叙述错误的是( )
A.为获得无菌培养物，外植体要消毒处理后才可接种培养
B.组织培养过程中也可无明显愈伤组织形成，直接形成胚状体等结构
C.提高培养基中生长素和细胞分裂素的比值，有利于诱导生根
D.用同一植株体细胞离体培养获得的再生苗不会出现变异
随堂检测
2.植物细胞工程包括植物组织培养、植物体细胞杂交等技术，具有广泛的应用前景和实用价值。下列对这些操作或应用描述错误的是( )
A.通过植物组织培养技术实现种苗的大量繁殖,可保持优良品种的遗传特性
B.以茎尖为材料利用植物组织培养技术，可获得具有抗病毒特性的新品种
C.利用植物体细胞杂交技术获得白菜—甘蓝杂种植株，打破了生殖隔离
D.利用植物细胞培养技术可大量获得紫草宁，且已投入规模化生产
答案：B
解析：通过植物组织培养实现种苗的大量繁殖，利用的原理是植物细胞具有全能性，并没有改变遗传物质，因而可以保持优良品种的遗传特性，A正确；以根尖或茎尖为材料，利用植物组织培养技术可获得脱毒植株，但不能获得抗病毒的新品种，利用转基因技术可获得抗病毒的新品种，B错误；白菜和甘蓝属于不同的物种，利用植物体细胞杂交技术获得白菜—甘蓝杂种植株，打破了生殖隔离，克服了生物远缘杂交不亲和的障碍，C正确；利用植物组织培养技术可进行细胞产物的工厂化生产，如大量获得紫草宁，且已投入规模化生产，D正确。
1.植物组织培养技术常用于商业化生产，其过程一般为：无菌培养物的建立→培养物增殖→生根培养→试管苗移栽及鉴定。下列相关叙述错误的是( )
A.为获得无菌培养物，外植体要消毒处理后才可接种培养
B.组织培养过程中也可无明显愈伤组织形成，直接形成胚状体等结构
C.提高培养基中生长素和细胞分裂素的比值，有利于诱导生根
D.用同一植株体细胞离体培养获得的再生苗不会出现变异
随堂检测
3.研究者通过体细胞杂交技术，探索利用条斑紫菜和拟线紫菜培育杂种紫菜。下列相关叙述正确的是( )
A. 从食用紫菜的动物消化道内提取蛋白酶，用于去除细胞壁
B. 原生质体需在低渗溶液中长期保存，以防止过度失水而死亡
C. 检测原生质体活力时可用苯酚品红或甲紫溶液处理，活的原生质体被染色
D. 聚乙二醇促进原生质体融合后，以叶绿体颜色等差异为标志可识别杂种细胞
答案：D
解析：去除植物细胞壁需要使用纤维素酶和果胶酶，A错误； 原生质体需置于等渗溶液中，置于低渗溶液中，原生质体会吸水涨破，B错误；检测原生质体活力时可用苯酚品红或甲紫溶液处理，死的原生质体被染色，C错误； 聚乙二醇促进原生质体融合后，两个细胞的叶绿体颜色有差异，可以以叶绿体颜色等差异为标志可识别两种细胞融合后的杂种细胞， D正确。

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