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(共26张PPT)
2.2动物细胞工程
二、动物细胞融合技术与单克隆抗体
什么是动物细胞融合技术？
单克隆抗体是如何制备的 在临床上有哪些应用？
本节聚焦
1
2
A细胞
B细胞
正在融合的原生质体
再生出细胞壁
高Ca2+ —高pH融合法等
脱分化
再分化
移栽
植物细胞融合
植物组织培养
杂种植株
愈伤组织
A原生质体
B原生质体
移栽后的植株
植物体细胞杂交技术
植物体细胞杂交技术的优势：
打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育出新的作物类型。　　　　
回顾旧知
实验：人——鼠细胞荧光标记融合实验
融合细胞
细胞
融合
37℃
40min
正在融合的细胞
红色荧光染料标记膜蛋白
绿色荧光染料标记膜蛋白
人细胞
小鼠细胞
该实验说明：
细胞膜具有流动性
有没有技术能让不同种动物的体细胞杂交，培育出集不同细胞的优势于一身的动物细胞呢？　
回顾旧知
1.概念：
2.原理：
3.融合方法：
4.意义：
使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。
细胞膜的流动性
PEG融合法、电融合法和灭活病毒诱导法等。
（化学法、 物理法、 生物法 ）
突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。已成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段，特别是杂交瘤技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。
动物细胞融合特有
杂交细胞：具有原来两个或多个细胞的遗传信息
01
动物细胞融合技术
灭活是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，
但并不破坏它们的抗原结构。灭活病毒诱导细胞融合的原理是：
病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生
作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
动物细胞融合实质及完成的标志：细胞核的融合
相关信息
注意说明
动物细胞融合与受精作用的区别
（1）受精作用：是在同种生物之间进行的，精子与卵细胞的融合不需要任何诱导剂，受精卵内具备同种生物的两个亲本的遗传物质。
（2）动物细胞融合可在不同物种间进行，由于物种间存在生殖隔离，所以自然条件下不能融合成杂交细胞，必须有诱导剂才能融合。形成的杂交细胞具备两个亲本细胞的遗传物质，从而体现两个亲本的遗传特性。
1.早期获得抗体的方法：
向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物血清中分离所需抗体。
抗体不纯
为解决这一难题，科学家进行了多年的研究和探索。
02
单克隆抗体及其应用
缺点：
产量低、纯度低、特异性差
2.科学家发现哺乳动物感染病原体后，体内会形成相应的B淋巴细胞，这些细胞能分泌抗体，抗体识别并特异性结合病原体，从而抑制病原体的增殖等。动物体内产生的特异性抗体种类超过百万种，但每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。因此，要想获得大量单一抗体，必须克隆单一的B淋巴细胞，形成细胞群。
遗憾的是，在体外培养条件下，一个B淋巴细胞是不可能无限增殖的。
如何解决这一难题？
02
单克隆抗体及其应用
3.1975年，英国科学家米尔斯坦和德国科学家科勒在前人工作的基础上，充分发挥想象力，设计了一个极富创造性的实验方案：
一种B淋巴细胞
（只产生一种特定抗体）
能在体外大量增殖的骨髓瘤细胞
融合
杂交瘤细胞
产生足够数量的特定抗体
米尔斯坦
科勒
由于发明了单克隆抗体的制备技术，米尔斯坦和科勒于1984年获得了诺贝尔生理学或医学奖。
大量
增殖
单克隆抗体
单克隆抗体：由单个B淋巴细胞经过克隆（无限增殖），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体。
4.单克隆抗体制备的过程：
注射特定的抗原
培养骨髓瘤细胞
从脾中提取
B淋巴细胞
多种
骨髓瘤细胞
诱导融合
将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合
能产生抗体，但不能大量增殖
不能产生抗体，但能大量增殖
PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法
4.单克隆抗体制备的过程：
多种杂交细胞：
未融合的细胞
B-骨
骨-骨、
B-B、
第一次筛选：
用特定的选择培养基
在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长
杂交瘤细胞：
（既能迅速大量增殖，又能产生抗体）
第二次筛选：
克隆化培养、抗体检测
（可进行多次）
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞
（分泌的抗体能与特定抗原结合）
每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞
克隆化培养
多孔细胞培养板
（能产生所需抗体的杂交瘤细胞）
4.单克隆抗体制备的过程：
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞
（分泌的抗体能与特定抗原结合）
注射到小鼠腹腔内
体外培养
单克隆抗体
从细胞培养液中提取
从小鼠腹水中提取
（能产生所需抗体的杂交瘤细胞）
单克隆抗体的优点：
特异性强、灵敏度高、可大量制备
第一次筛选
（1）筛选原因：诱导融合后得到多种杂交细胞，另外还有未融合的细胞。
骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合
（2）筛选方法：用特定的选择培养基筛选：未融合的细胞和同种融合后形成的细胞（“B-B细胞”、“瘤-瘤细胞”）都会死亡，只有杂交瘤细胞（“B-瘤细胞”）才能生长。
杂交瘤细胞
选择培养基
（3）筛选目的：得到杂交瘤细胞。
注意说明
第二次筛选
（1）筛选原因：由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经第一次筛选获得的杂交瘤细胞中存在产生其他抗体的细胞。
（2）筛选方法：用多孔培养皿培养，在每个孔内只有一个杂交瘤细胞的情况下开始克隆化培养和抗体检测，经多次筛选得到能产生特异性抗体的细胞群。
（3）筛选目的：得到能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。
杂交瘤细胞
多孔培养板
克隆化培养和抗体检测
筛选抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞
既能迅速大量增殖
又能产生特异性抗体
注意说明
应用到的技术：
原理：
细胞膜具有一定的流动性、细胞增殖
多种杂交细胞及未融合的细胞
诱导 融合
小鼠骨髓瘤细胞
多种B淋巴细胞
给小鼠注射特定抗原
提取
杂交瘤细胞
第一次筛选
用特定的选择性培养基
第二次筛选
足够数量的能产生所需抗体的杂交瘤细胞
体外培养
注射到小鼠腹腔
大量单克隆抗体
克隆化培养、抗体检测
（既能迅速大量增殖，又能产生抗体）
（产生抗体）
（能无限增殖）
从腹腔液中提取
从培养液中提取
（可进行多次）
动物细胞融合
动物细胞培养
归纳
单克隆抗体的应用
资料1 用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的“早早孕诊断试剂盒”。在妊娠第8天就可以作出诊断，这比原来的诊断方法提前了10d左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。
资料2 使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素没有特异性，
在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用。抗体-药物偶联物（antibody-drugconjugates, ADC）通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由抗体、接头和药物(如细胞毒素)三部分组成，它的作用机制如下图所示。
抗体
药物
接头
ADC被细胞吞噬
释放药物
溶酶体裂解
细胞凋亡
1. ADC的抗体和药物各具有什么作用？
讨论：
提示：抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞；
药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。
2. 除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？
3. 单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？
提示：① 可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗；
② 一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路
来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗
提示：① 单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高；生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用，有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒；② ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。
4. 单克隆抗体在临床上还有哪些应用？你可以课后搜集资料，然后以“单克隆抗体在临床上的应用”为主题，出一期黑板报或制作电子板报宣传相关知识。
提示： 单克隆抗体在临床上的应用涉及治疗、诊断等方面。单克隆抗体药物已被广泛用于肿瘤、自身免疫病等疾病的治疗，如利妥昔单抗被用于治疗复发难治的低分化B细胞淋巴瘤；曲妥珠单抗被用于治疗乳腺癌等。在临床诊断方面，单克隆抗体被广泛用于-些感染性疾病的检测、肿瘤的诊断、激素和细胞因子的测定等。以单克隆抗体在诊断肿瘤方面的应用为例，用放射性同位素或荧光标记抗肿瘤表面抗原的单克隆抗体，可以用这些抗体来对体内的肿瘤进行定位，辅助诊断并确定肿瘤的复发与转移等。
（1）广泛用作诊断试剂
抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体
5.单克隆抗体的应用
乙肝测定试剂
艾滋病检测试剂
（2）可以运载药物
5.单克隆抗体的应用
结合同位素的单克隆抗体药物
主要用于癌症治疗。如：单克隆抗体+接头+药物（如细胞毒素）=ADC
优点：位置准确、疗效高、副作用小
（3）用于治疗疾病
5.单克隆抗体的应用
练习与应用
一、概念检测
1.下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的是（ ）
A.它们的原理都涉及细胞膜的流动性
B.都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合
C.融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞
D.前者主要是为了获得细胞产品，后者主要是为了获得杂种植株
2.科学家以SARS病毒的核衣壳蛋白为抗原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确的是（ ）
A. 利用该单克隆抗体可以诊断是否感染SARS病毒
B.体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对SARS病毒的单克隆抗体
C.将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合，经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞
D.将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，从小鼠血清中分离出的抗体为单克隆抗体
C
A
二、拓展应用
假如你掌握了动物细胞融合技术，你想用这种技术来解决哪些问题 解决这些问题的大致思路是怎样的 这样做会有什么风险 请查阅相关资料，完善自己的思路，并形成文字报告，与同学交流。
提示：可以利用动物细胞融合技术培育多倍体胚胎，研究其发育机制，甚至可能培育出新的物种。但是，目前相关技术还不成熟，存在融合率低、胚胎死亡率高等问题，并且还可能带来一些伦理方面的问题。
练习与应用

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