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第3章 基因工程
第2节 基因工程的基本操作程序-1
基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？
基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪些？
本节聚焦
1
2
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知道转基因抗虫棉的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？
【从社会中来】
转基因抗虫棉与普通棉花
提示：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫，将该细菌的“杀虫基因”转到棉花里，让棉花也能产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。
苏云金杆菌
与载体拼接
普通棉花
（无抗虫特性）
棉花细胞
抗虫棉
提取
表达Bt基因
导入
Bt基因
重组DNA分子
培育转基因抗虫棉的简要过程
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的 检测与鉴定
【从社会中来】
DNA片段
基因1 基因2 基因3
放大
终止子
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
启动子
原核基因
终止子
编码区
非编码区
非编码区
内含子
外显子
启动子
编码区上游
编码区下游
真核基因
知识补充
基因的结构
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
启动子
终止子
①编码区：能转录相应的mRNA，进一步编码出蛋白质的DNA序列。
②非编码区：不编码蛋白质,含有能调控遗传信息表达的DNA序列(如启动子、终止子）。
原核细胞的基因结构：
原核基因
（连续的）
编码区
非编码区
非编码区
内含子
外显子
启动子
终止子
编码区上游
编码区下游
真核基因
编码区
非编码区：
能转录相应的mRNA，进一步能编码蛋白质的DNA序列
能转录相应的mRNA，然后在翻译前就被剪切掉，不能编码蛋白质的DNA序列
不编码蛋白质，含有能调控遗传信息表达的DNA序列，包括启动子、终止子等。
外显子：
内含子：
真核细胞的基因结构：
（不连续）
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
启动子
终止子
编码区
非编码区
非编码区
内含子
外显子
启动子
终止子
编码区上游
编码区下游
原核基因
真核基因
RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动转录
启动子
终止子
本质：
位置：
作用：
是一段特殊序列结构的DNA片段；
位于基因上游；
本质：
位置：
作用：
是一段特殊序列结构的DNA片段；
位于基因下游；
终止转录
基因工程的一般操作程序主要包括四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
1.目的基因的筛选与获取
4.目的基因的检测与鉴定
2.基因表达载体的构建
3.将目的基因导入受体细胞
基因工程的基本操作程序
基因工程的基本操作程序
定义：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等相关的基因。
根据不同的需要，目的基因不同，主要是指编码蛋白质的基因。
如：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。
资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt 抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。
科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt 抗虫蛋白抵抗虫害。
目的基因
1.目的基因
01
目的基因的筛选与获取
从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选目的基因
科学家已经明确Bt基因的序列信息，也对Bt抗虫蛋白有深入了解
利用序列数据库（如GenBank）、序列对比工具（如BLAST）等，找到合适的目的基因
问题：筛选出来的目的基因如何获取？
01
目的基因的筛选与获取
2.筛选合适的目的基因
PCR
基因文库
包括
生物材料
获取目的基因
DNA
cDNA
一定大小范围的DNA
mRNA
基因组文库 cDNA文库
限制酶
酶切
逆转录
导入受体菌中保存
01
目的基因的筛选与获取
3.从生物材料获取目的基因的方法
基因组文库
部分基因文库（主要是cDNA文库）
基因文库：
基因组文库：含有某种生物全部基因片段的重组DNA的克隆群体。
①从基因文库中直接获取
部分基因文库：含有某种生物部分基因片段的重组DNA的克隆群体。
01
目的基因的筛选与获取
3.从生物材料获取目的基因的方法
基因组文库
从细胞中提取DNA
细胞
基因组DNA
质粒
质粒酶切
DNA连接酶连接
限制酶酶切
导入细菌中
基因组文库克隆
提取
酶切的DNA片段
cDNA文库
逆转录
逆转录酶
酶切的cDNA片段
限制酶酶切
质粒
质粒酶切
连接
导入细菌中
cDNA文库克隆
提取
基因组DNA限制酶酶切
mRNA逆转录得cDNA
拼接质粒，导入细菌中保存为文库
基因组文库
cDNA文库
选择含有目的基因的克隆，用构建文库时的限制酶切割获得目的基因
②获取目的基因的方法有多种，现在，常用PCR特异性地快速扩增目的基因
发明者：穆里斯；
PCR是聚合酶链式反应的缩写；
PCR的原理：依据半保留复制，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
01
目的基因的筛选与获取
3.从生物材料获取目的基因的方法
3′
5′
DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有链的3′-端，即子链的延伸方向是5 ′→3 ′。
由于DNA聚合酶不能将单个的核苷酸链连接成链，因此子链合成需要引物（最初的已有链）。
DNA聚合酶
3′
5′
模板链
体内DNA复制参与的组分 在DNA复制中的作用 PCR中参与的组分
打开DNA双链
提供DNA复制的模板
合成子链的原料
催化合成DNA子链
使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
说明：
PCR所用原料实为dNTP，dNTP和ATP类似可以通过基团转移为反应提供能量。
解旋酶
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物（通常为小的单链RNA）
无需解旋酶，用高温代替
DNA母链
4种脱氧核苷酸
耐高温的DNA聚合酶
引物（通常为小的单链DNA）
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
反应还需要其它条件，如缓冲液等
4.利用PCR获取和扩增目的基因（DNA复制所需的基本条件）
条件
4.利用PCR获取和扩增目的基因（PCR扩增的过程）
5’ 3’
3’ 5’
3’ 5’
5’ 3’
5’ 3’
引物1
3’ 5’
引物2
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
引物2
5’ 3’
引物1
5’ 3’
引物1
3’ 5’
引物2
3’ 5’
引物2
5’ 3’
引物1
目的基因
条件：DNA模板、4种脱氧核苷酸、引物和TaqDNA聚合酶
过程：变性→延伸→退火
4.利用PCR获取和扩增目的基因（PCR扩增的过程演示）
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
引物2
5’ 3’
引物1
5’ 3’
引物1
3’ 5’
引物2
3’ 5’
引物2
5’ 3’
引物1
3’ 5’
5’ 3’
引物1
5’ 3’
引物1
3’ 5’
引物2
5’ 3’
引物1
3’ 5’
引物2
5’ 3’
引物1
3’ 5’
引物2
3’ 5’
引物2
5’ 3’
引物1
5’ 3’
引物1
3’ 5’
引物2
5’ 3’
3’ 5’
引物2
5’ 3’
引物1
3’ 5’
引物2
受热变性
引物
耐高温的
DNA聚合酶
(1)过程：
（2）结果：1个模板DNA分子经过n轮PCR，以_____方式扩增，可以扩增出 个DNA片段。　　　　
指数
2n
01
目的基因的筛选与获取
PCR小结
基因工程的核心是基因表达载体的构建，其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。同时使目的基因能够表达和发挥作用。
一个基因表达载体的组成，除了有目的基因外，还必须有启动子、终止子、标记基因等。
02
基因表达载体的构建
1.目的
2.基因表达载体的组成
③标记基因的作用：用于鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，如抗生素抗性基因就可以作为标记基因。
①启动子：启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能够驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类所需的蛋白质。
②终止子：位于基因的下游，也是一段有特殊序列结构的DNA片段，是转录过程终止的信号。
2.基因表达载体的组成
pBI121载体
多克隆位点是目的基因插入部位，一般具有多种限制酶的酶切位点
RNA聚合酶识别位点，启动转录。具有物种和组织细胞特异性
负责将其间序列插入至染色体DNA
抗卡那霉素基因，用于重组体的筛选
T-DNA
T-DNA
动
子
启
标
R
记
基
因
Kan
多
克
隆
位
点
复制
原点
终
子
止
转录终止信号
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
目的基因
限制酶切割位点
先用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶（同尾酶）切割载体和含有目的基因的片段，再用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体上，形成重组DNA分子。
标记基因
启动子
限制酶切割位点
终止子
复制原点
限制酶
限制酶
DNA连接酶
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
3.基因表达载体的构建程序
GGATCCAAGCTTGGG
CCTAGGTTCGAACCC
CCCAAGCTT
GGGTTCGAA
BamH Ⅰ
Hind Ⅲ
Xba Ⅰ
Sma Ⅰ
Hind Ⅲ
Hind Ⅲ
BamH Ⅰ
Bt基因
多
克
隆
位
点
动
子
启
终
子
止
标
R
记
基
因
Kan
复制
原点
问题：选用哪种限制酶同时切割Bt基因和pBI121？
5′
5′
3′
3′
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
AGCTT
A
GGATCCA
CCTAGGTTCGA
Bt
Bt基因
Bt基因
Bt基因
Bt基因
Hind Ⅲ单酶切
DNA连接酶
5′
5′
5′
5′
Bt
Bt
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
AGCTT
A
G
CCTAG
Bt基因
双酶切优点：
利于载体与目的基因正确结合，避免反向连接和自身环化
大肠杆菌自身修复，比例很少
Hind Ⅲ与BamH Ⅰ双酶切
DNA连接酶
Bt基因
Bt基因
Bt
基因
5′
5′
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
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