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第3章 基因工程
第2节 基因工程的基本操作程序-2
基因工程的一般操作程序主要包括四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
1.目的基因的筛选与获取
4.目的基因的检测与鉴定
2.基因表达载体的构建
3.将目的基因导入受体细胞
基因工程的基本操作程序
基因工程的基本操作程序
转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。基因工程中不同生物转化方法不同。
受体细胞
将目的基因导入
植物细胞
将目的基因导入
动物细胞
将目的基因导入
微生物细胞
农杆菌转化法
花粉管通道法
——显微注射法
——Ca2+处理法
1.转化
2.转化的受体细胞
03
将目的基因导入受体细胞
花粉
外源DNA
花粉管
子房
胚珠
导入植物细胞（植物细胞转化方法）：
花粉通道法
花粉管
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
03
将目的基因导入受体细胞
农杆菌转化法
Ti质粒
T-DNA
目的基因
构建表达载体
含目的基因的Ti质粒
转入农杆菌
含重组Ti质粒的农杆菌
导入植物细胞
表现新性状的植物
植物细胞
染色体DNA
植物叶片切下与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，或将花序培养在农杆菌溶液中，获得种子，然后筛选、鉴定
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
03
将目的基因导入受体细胞
导入动物细胞（动物细胞转化方法） ：
常用显微注射法将目的基因注入受精卵
导入细菌（细菌转化方法）
一般用Ca2+处理使大肠杆菌处于一种易于吸收周围环境中DNA分子的生理状态（感受态），然后将重组的基因表达载体导入其中。
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
03
将目的基因导入受体细胞
导入卵细胞（受精卵）可以获得稳定遗传的个体
检测目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。
类型 检测内容 方法
分子水平的检测
个体生物学水平的鉴定
受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因
目的基因是否转录出了mRNA
PCR等技术
目的基因是否翻译成蛋白质
抗原-抗体杂交技术
个体是否具有相应性状
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
04
目的基因的检测与鉴定
1.目的
2.检测内容及方法
分子水平的检测
1.基因是否插入染色体DNA（存在）
非转基因棉花
转基因抗虫棉
阴性对照
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
PCR
04
目的基因的检测与鉴定
分子水平的检测
2.基因是否转录
Bt
M3
C0
T-9
T-2
T-51
T-5
T-23
T-11
T-20
T-21
T-34
T-10
RT-PCR
10个PCR阳性棉花植株中，有四株Bt基因发生转录
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
04
目的基因的检测与鉴定
分子水平的检测
3.基因是否翻译为蛋白质
Bt抗虫蛋白
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
04
目的基因的检测与鉴定
个体生物学水平的鉴定
接种棉铃虫观察性状表现，或采摘抗虫棉的叶子饲喂棉铃虫，观察抗虫效果。
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
04
目的基因的检测与鉴定
04
目的基因的检测与鉴定
获取质粒、噬菌体等载体
筛选和获得目的基因
用限制酶切割载体和含有目的基因的DNA片段，然后用DNA连接酶连接，构建基因表达载体
将含有目的基因的表达载体导入受体细胞
检测和鉴定目的基因是否稳定维持和表达其遗传特性
基因工程的基本操作程序
转基因抗虫棉在世界范围被广泛种植，有效控制了棉铃虫的种群数量，显著减少了农药的用量。面对棉铃虫的危害，有了抗虫棉是否就可以一劳永逸、高枕无忧呢？根据棉铃虫对传统农药产生抗性的发展历史，科研人员推测棉铃虫中存在对Bt抗虫蛋白产生抗性的可能。请你查阅资料，了解以下问题：
1．在实际种植过程中，棉铃虫是否对转Bt基因的抗虫棉产生了严重的抗性？证据是什么？
2．科研工作者在发现棉铃虫出现抗性之前，就应该想办法应对。他们想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有哪些？这些措施的原理是什么？有效吗？
【到社会中去】
学生课后自行讨论解答
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究·实践
（1）DNA片段的扩增
①利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增。
②PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
③PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。一次PCR一般要经历30次循环。
（2）DNA片段的电泳鉴定
①DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
②PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色（EB染色），可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
实验原理
（1）仪器
（2）用具
PCR 仪、微量离心管、微量移液器、一次性吸液枪头、电泳装置（包括电泳仪电泳槽等）
4种脱氧核苷酸的等量混合液、2种引物、DNA 聚合酶、模板 DNA 、扩增缓冲液、无菌水、电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等
PCR仪
微量离心管
微量移液器
电泳装置
探究·实践
DNA片段的扩增及电泳鉴定
材料用具
微量离心管
推动杆
调节旋钮
卸枪头按钮
体积刻度
吸液杆
枪头
（注意：加不同样品时，需要更换枪头）
PCR反应体系的配方 10倍浓缩的扩增缓冲液 5 μL
20 mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液 1 μL
20 μmol/L的引物Ⅰ 2.5 μL
20 μmol/L的引物Ⅱ 2.5 μL
H2O 28～33 μL
1～5 U/μL的Taq DNA聚合酶 1～2 U
模板DNA 5～10 μL
总体积 50 μL
注：模板DNA的用量为1gp～1μg 1．PCR加样操作
按照右表，用微量移液器依次将各组分加入微量离心管中。（注意：酶和缓冲液要在冰块上缓慢融化，用后置于-20℃冰箱中保存。酶和缓冲液一般分装成小份，避免反复融化导致活性降低甚至失活）
方法步骤
2．离心
盖严离心管，离心10s，使反应液集中在离心管底部。
3 ．PCR
参照上表设置PCR循环程序。
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 94℃，5min
30次 94℃，30s 55℃，30s 72℃，1min
最后1次 94℃，1min 55℃，30s 72℃，1min
4．制备凝胶
根据DNA片段大小，用电泳缓冲液配制适合浓度的琼脂糖溶液（一般为0.8%～1.2%）。琼脂糖用沸水浴或微波炉熔化，稍冷却加入适量核酸染料混匀。
将琼脂糖溶液倒入模具，并插入大小合适的梳子（用以形成加样孔）。
待凝胶凝固后，将梳子拔出。
5．电泳加样
将凝胶放入电泳槽，加电泳缓冲液没过凝胶约1cm。将PCR扩增产物与凝胶载样缓冲液（内含有指示剂）混合，用移液器缓慢注入加样孔。其中一个加样孔中加入Maker。
6．电泳
接通电源，设定电压（一般1～5V/cm），待指示剂前沿迁移至接近凝胶边缘时，停止电泳。
7．观察、照相
取出凝胶在紫外灯下观察、照相。
注意事项
1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
提示：可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。
提示：如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
结果分析与评价
例1：用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出分析不合理的是(　　)
A.PCR产物的分子大小在250至500 bp之间
B.3号样品为不含目的基因的载体DNA
C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株
D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰
B
典例分析
例2：通过引物设计运用PCR技术可以实现目的基因的定点突变.图1为基因工程中获取突变基因的过程，其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对，但不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中引物1和引物2的5'端分别设计增加限制性内切酶a和限制性内切酶b的识别位点.有关叙述正确的是（ ）
A.两种引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因的定向插入
B.在PCR反应体系中还需要加入4种游离核糖核苷酸、解旋酶、Taq酶、ATP等
C.第2轮PCR，引物1与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因
D.在第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/8
典例分析
A
本节思维导图
练习与应用
一、概念检测
1. 研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因加整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。
（1）将加基因整合到Ti质粒上就是构建基因表达载体。 （ ）
（2） 构建含有加基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶。 （ ）
（3） 只要检测出番茄细胞中含有物基因，就代表抗冻番茄培育成功。（ ）
2. 利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是 （ ）
A. PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶
B. 变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶
C. 复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D. 延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和 4种核糖核苷酸
√
×
×
D
二、拓展应用
1. 研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。
【提示】外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。
2. 八氢番茄红素合酶（其基因用psy表示） 和胡萝卜素脱饱和酶（其基因用crtl表示）参与β-胡萝卜素的合成。pmi为磷酸甘露醇异构酶基因，它编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。科学家将psy和crtl基因转入水稻，使水稻胚乳中富含β-胡萝卜素，由此生产出的大米称为 “黄金大米”。请根据以上信息回答下列问题。
普通大米（左）和“黄金大米”（右）
【这项研究成果发表在《自然 生物技术》（Nature Biotechnology ）杂志上】
（1）科学家在培育“黄金大米”时，将ctrl 和psy基因导入含pmi基因的质粒中，构建了质粒pSYN 12424。该项研究的目的基因是______ ，标记基因是_____ ，质粒pSYN 12424的作用是______ 。
【提示】ctrl 基因和psy基因 Pmi基因 将目的基因送入水稻细胞。
（2）在构建质粒载体时，目的基因序列中能否含有用到的限制酶的识别序列？为什么？
【提示】不能。如果目的基因序列中含有用到的限制酶的识别序列，限制酶可能将它切断。
二、拓展应用
（3）请查找相关资料，了解科学家为什么 要培育“黄金大米”以及当前关于“是否要推广 '黄金大米’”的各种争论。你还可以提出自己的看法，并与同学交流讨论。
【提示】维生素A在人体内具有非常重要的生理功能，对视力、骨骼生长、免疫功能等都有调节作用。但是，人体不能合成维生素A，需要从食物中摄取。维生素A缺乏症是南亚地区常见的由营养不良导致的疾病，该地区的居民一般以籼稻作为主食。β-胡萝ト素是维生素A的前体，在人体内它可以转化为维生素A。因此，科学家将两个参与β-胡萝ト素合成的酶的基因转入了籼稻中，使其胚乳中富含β-胡萝ト素，期望让人们通过日常食用主食就能补充足够量的维生素A，从而降低维生素A缺乏症的患病率。关于“是否要推广“黄金大米””的争论主要围绕其安全性、有效性等方面展开。在学生交流讨论的过程中，教师要注意引导他们理性地表明观点和参与讨论。
二、拓展应用
谢谢观看

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