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(共25张PPT)
3.1重组DNA技术的基本工具
老师：XXXXX
基因工程
中国棉花
1992年，一场史无前例的棉铃虫灾害吞噬着中国的棉田，我国棉花产业遭遇灭顶之灾;
国外公司拒绝出售抗虫棉核心技术，到1999年外国抗虫棉已占领我国95%的棉花市场份额，国内棉花品种市场迅速流失。
棉花棉铃虫幼虫
中国棉花
1998年中棉所成功培育出我国第一个国审抗虫杂交棉新品种--中棉所29，使低龄棉铃虫的死亡率超过90%;
2002年成功培育出我国第一个双价转基因抗虫棉新品种--中棉所41，该品种能够缓解棉铃虫抗药性。
我国成为世界第二个拥有抗虫基因自主知识产权的国家。
基因工程
概念：指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
基因工程的别名 基因拼接技术或重组DNA分子
操作环境 生物体外
操作对象 基因
操作水平 DNA分子水平
基本过程 剪切，拼接，导入，表达
结果 定向改变生物的遗传性状，创造出新的生物类型
基因工程
一
二
三
DNA双螺旋结构是谁建立的？
证明DNA是半保留复制的科学家是谁？
第一个基因工程药物是什么？
阅读课本68页-69页，回答下列的问题
让我们一起来看看基因工程的诞生和发展吧~
基因工程
“工欲善其事，必先利其器”。在培育转基因生物时，既要在体外对含有所需基因的DNA分子“切割”、改造和“拼接”;又要将重组DNA分子导入生物体内，并使其表达。DNA双螺旋的直径只有2nm，对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。
科学家究竟用到了哪些“分子工具” 这些“分子工具”各具有什么特征呢
CONTENTS
01
限制性内切核酸酶—“分子手术刀“
Part One
02
DNA连接酶—”分子缝合针“
Part Two
03
基因进入受体细胞的载体—”分子运输车“
Part Three
04
DNA的粗提取与鉴定
Part Four
CONTENTS
01
限制性内切核酸酶—“分子手术刀“
Part One
限制性内切核酸酶
限制性核酸内切酶（简称限制酶）---“分子手术刀”
1.来源:主要从原核生物中分离纯化出来的。
2.作用:
(1)识别双链DNA分子的特定核苷酸序列
（大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，例如EcoRI和SmaI限制酶的识别序列均为6个，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。）
(2)切开每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
3.种类:数千种
限制性内切核酸酶
4.作用结果：形成DNA片段末端。
a.黏性末端：限制酶在其识别序列的中轴线两侧将DNA的两条链分别切开时形成的末端; 黏性末端DNA两条链的切口带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对。
b.平末端：限制酶在其所识别序列的中心轴线处切开时形成的末端。
限制性内切核酸酶
请问限制酶切割的部位在1,2,3,4中的哪里呢？
CONTENTS
02
DNA连接酶—
”分子缝合针“
Part Two
DNA连接酶
1.作用
将限制酶切割下来的DNA片段“缝合”，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键，拼接成新的DNA分子。
2.类型
常用类型 E·coli DNA连接酶 T4DNA连接酶
来源 大肠杆菌 T4噬菌体
功能 只“缝合”互补的黏性末端 “缝合”黏性末端和平末端
结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 CONTENTS
03
基因进入受体细胞的
载体—”分子运输车“
Part Three
基因进入受体细胞的载体
1.作用：
作为运载工具，将目的基因送入受体细胞;
在受体细胞内对目的基因进行大量复制。(可以自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制)
2.作为载体的必要条件：
①能够在受体细胞中复制并稳定地保存(能进入受体细胞并在受体细胞内复制并表达);
②具有一个至多个限制酶切割位点(便于与不同目的基因结合);
③有某些特殊的标记基因 ，如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等(便于鉴定和筛选);
④对受体细胞无害、易分离。
基因进入受体细胞的载体
3.种类：质粒、噬菌体、动植物病毒等。
4.常用载体——质粒
①质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子;
②质粒DNA分子上有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段(基因)插入其中;
③质粒DNA分子上有特殊的标记基因，如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等，便于重组DNA分子的筛选;
④在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上经过人工改造的。
CONTENTS
04
DNA的粗提取与鉴定
Part Four
DNA的粗提取和鉴定
实验原理
材料用具
实验步骤
粗提取原理
鉴定原理
DNA的粗提取与鉴定 实验原理
1、实验原理
(1)DNA粗提取原理：利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
①DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质。
②DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。 DNA与蛋白质在NaCl溶液中的溶解度如下表：
DNA的粗提取与鉴定
溶解规律 2 mol/L NaCI溶液 0.14 mol/L NaCI溶液
DNA 溶解 析出
蛋白质 NaCl溶液物质的量浓度从2mol/L逐渐降低的过程中，溶解度逐渐增大 部分发生盐析沉淀 溶解
DNA的粗提取与鉴定
1、实验原理
(2) DNA的鉴定原理：在沸水浴的条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DN A的试剂。
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DNA的粗提取与鉴定
材料用具
1.实验材料的选择：
原则上，凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。选取的材料不同，提取DNA的方法可能稍有不同。
材料：新鲜洋葱(或选择香蕉、菠菜、菜花和猪肝等)
研磨液、体积分数为95%的酒精、2mol/L的NaCl溶液、二苯胺试剂和蒸馏水等。
2.实验用具：烧杯、量筒、玻璃棒、研钵、纱布、漏斗、试管、试管架、试管夹、酒精灯、石棉网、三脚架、火柴、刀片和天平等。
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DNA的粗提取与鉴定
实验步骤
DNA粗提取
1.破碎细胞(以洋葱为例)：切碎洋葱→放入研钵→加研磨液→充分研磨
2.收集滤液方法：
方法①：纱布过滤洋葱研磨液→4℃冰箱中放置几分钟后，取上清液
方法②：直接将研磨液在1500r/min的转速下离心5min，再取上清液
3.DNA的析出：在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2-3min，溶液中出现的白色丝状物(粗提取的DNA)。
4.DNA的获取：
方法①：用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分
方法②：将溶液在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，留沉淀物
DNA的粗提取与鉴定
实验步骤
DNA鉴定
取两支20mL的试管，各加入2molL的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。然后，向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。
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