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柱色谱应用
柱色谱法，又称层析法。是一种以分配平衡为机理的分配方法。色谱体系包含两个相：固定相和流动相。当两相相对运动时，反复多次的利用混合物中所含各组分分配平衡性质的差异，最后达到彼此分离的目的。主要分为以下几种类型：
液-固吸附色谱
液-液吸附色谱
离子交换色谱
离子对色谱
分子排斥色谱
亲和色谱
（一）液-固吸附柱色谱法（liquid-solid adsorption chromatography）
固定相：固体吸附剂，流动相：液体
原理：利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异
K越大，组分越容易被吸附，保留时间越长，迁移速度越慢，
后流出色谱柱。
吸附平衡
吸附系数（平衡常数）
柱色谱应用
1.吸附剂
吸附剂为多孔性微粒物质。常用的有硅胶、氧化铝、聚酰胺和大孔吸附树脂等。
需满足以下条件：
具有较大的吸附表面和吸附中心；
与样品、溶剂和洗脱剂均不发生化学反应；
不能被溶剂或洗脱剂溶解；
粒度均匀，且有一定的粒度。
柱色谱应用
（1）硅胶 适用于酸性或中性物质
（2）氧化铝
碱性氧化铝 pH 9.0～10.0 适于分析碱性、中性物质
中性氧化铝 pH＞7.5 适于分析酸性碱性和中性物质
酸性氧化铝 pH 4.0～5.0 适于分析酸性、中性物质
（3）聚酰胺 氢键作用，氢键能力↑强，组分越后出柱。
注：吸附剂含水量越大，活性级别越高，吸附活性越低，吸附能力越弱。常用的活化方法是加热除水。
（4）大孔吸附树脂
柱色谱应用
2.流动相
流动相具有洗脱作用。其洗脱能力决定于流动相占据吸附剂表面活性中心的能力。极性强的流动相分子，具有强的洗脱作用。极性弱的流动相洗脱作用弱。
为了使样品中吸附能力稍有差异的各组分分离，需同时考虑到被分离物质的性质、吸附剂的活性和流动相的极性三方面的因素。
柱色谱应用
被分离物质的结构与性质
极性越大，越容易被吸附，吸附能力越大。
吸附剂的选择
吸附剂的活性越大，对被测组分的吸附能力越强
流动相的选择 “相似相溶”原则
三者关系：
组分 吸附剂 流动相
极性大 活性小 极性大
极性小 活性大 极性小
柱色谱应用
3.操作方法
（1）装柱（干法和湿法）
柱装的要均匀，不能有缝隙或气泡，以免影响分离效果。
（2）加样
（3）洗脱
洗脱剂可以是一种溶剂或混合溶剂。在洗脱过程中应不断加入
洗脱剂，保持色谱柱顶有一定高度的液面，控制好洗脱剂的流速。
柱色谱应用
（二）液-液分配色谱（liquid-liquid adsorption chromatography）
1.全多孔型担体
由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；
2.表面多孔型担体（薄壳型微珠担体）
30～40μm的玻璃微球，表面附着一层厚度为
1～2μm的多孔硅胶。表面积小，柱容量底；
柱色谱应用
3.化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。
特点: 稳定，耐水、耐光和耐有机溶，是目前应用最广、性能最佳的固定相。
a. 硅氧碳键型：≡Si—O—C
b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C
c. 硅碳键型：≡Si—C
d. 硅氮键型：≡Si—N
柱色谱应用
化学键合固定相的特点：
（1）传质快:表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；
（2）寿命长:化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定；
（4）选择性好:可键合不同官能团，提高选择性；
（5）有利于梯度洗脱；
存在着双重分离机制：(键合基团的覆盖率决定分离机理)高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主；
柱色谱应用
（三）离子交换色谱（ion-exchange chromatography）
原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；
固定相：阴离子或阳离子离子交换树脂；
流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；
阳离子交换：R-SO3H+M+ =R-SO3 M+H +
阴离子交换：R-NR4OH+X-=R-NR4 X+OH-
应用：离子、可离解的化合物、氨基酸和核酸等。
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固定相结构类别：
薄壳型离子交换树脂
担体：薄壳玻璃珠，表面涂约1%的离子交换树脂；
离子交换键合固定相
薄壳键合型；微粒硅胶键合型（键合离子交换基团）
树脂类别：
阴离子交换树脂（强碱性、弱碱性）
阳离子交换树脂（强酸性、弱酸性）
柱色谱应用
（四）离子对色谱 （ ion pair chromatography）
原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配；
阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子；
阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子；
反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C18柱)，含有阳离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+ X -后；在两相间分配。
柱色谱应用
（五）分子排斥色谱 （size- exclusion chromatography）
原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。
全部在死体积前出峰；
可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离。
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A
B
C
D
柱色谱应用
（六）亲和色谱 （Affinity chromatograph）
原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。
先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。
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