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第2章
常用提取分离方法及操作
学习要点
1、天然产物提取方法中常用的方法和技术；最重要的是溶剂法；
2、天然产物分离纯化常用哪些方法和技术；色谱技术是目前最重要的方法。
第一节 天然药物提取方法
提取：利用适当的溶剂或方法，
将所需成分尽可能从原料 中完全提出的过程。
第一节 天然药物提取方法
当我们从中药房取来一剂汤药，回到家后的任务就是将其倒入药罐中，加一定量的水，然后煎煮一定时间和次数。这里，我们服用的是煎好的汤汁而不是药材，这个汤汁就是提取液（或称提取物），这个过程就是一种提取过程。
由于科学技术的发展和制药工业的发展，今天不再只使用单一的水作提取溶剂，还可以使用乙醇、乙醚等许多有机溶剂；另外，除了使用溶剂外，还有其它方式可供提取过程选用，如水蒸汽蒸馏提法取挥发性成分，用超声、微波等技术替代传统的加热方式等等。
什么是提取
（一）溶剂提取法
理想溶剂：
原理：相似相溶原理
*对所需成分溶解度大
* 沸点适中容易回收
* 低毒安全
溶剂分类： ①水
②亲水性有机溶剂：能与水任意混溶（甲 醇、乙醇、丙酮）
③亲脂性有机溶剂：不与水任意混溶，可分层（正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、石油醚）
溶剂提取过程原理：
提取方法：
①冷提取：
浸渍法：药材+溶剂 浸泡
最简单的例子就是家庭制备药酒。在生产中，适用于有效成分遇热易破坏以及含淀粉、树胶、果胶、粘液质较多的天然药物的提取。溶剂多用乙醇；以水为溶剂提取时，时间不宜过久，否则易发霉变质，在制剂允许时可加入适当的防腐剂。
但提取率较差（因为物质的溶出过程是一可逆过程）。
渗漉法：
其方法是在一底部开口的容器中，将预先浸润的药材细粉装入，并注意压实（如同腌菜）。然后在药材顶部添加渗漉用的溶剂（如酸水、碱水或稀醇等）。打开底部开口，溶液将充满药材层的空间，发生浸渍过程；不断在顶部添加浸出用的溶剂，浸提溶液从渗漉筒下端流出并收集。该法的优点是：上层的溶液（或稀浸出液）由上至下置换下层溶出液，形成良好的浓度差，故浸出效率较高，同时存在有过滤过程，故浸出液较澄清。
但溶剂消耗量大、费时长、操作麻烦。
②热提法
煎煮法 就是使用水对中药材进行直接加热提取。加热可使溶剂加速对天然药物中活性成分提取。此法简便，但含挥发性成分及有效成分遇热易破坏的天然药物不宜用此法。对于含淀粉高的药材，煎煮后药液比较粘稠，过滤比较困难。
回流提取法 当准备采用有机溶剂作为提取溶剂时，由于有机溶剂多具有挥发性、易燃性和毒性，可采用回流提取法：即在加热容器顶部加装一冷凝装置，以减少溶剂消耗、对空气的污染和对人体的伤害。但受热易破坏的成分不宜用此法，且溶剂消耗量大，操作麻烦。
连续提取法 为了弥补回流提取法中需要溶剂量大，操作较烦的不足，可采用连续提取法。（其原理和仪器参考教材10页）
辅助提取方法:超声波辅助提取、微波辅助提取、酶提取法
（二）水蒸气蒸馏法
水蒸汽蒸馏法只适用于具有挥发性的，能随水蒸气蒸馏而不被破坏，与水不发生反应，且难溶或不溶于水的成分的提取。此类成分的沸点多在100℃以上，并在100℃左右有一定的蒸气压。
（三）升华法
天然药物中有一些成分具有升华性质，能利用升华的方法直接从中药中提取出来。如樟木中樟脑的提取。
（四）超临界流体萃取法
超临界萃取法是利用超临界状态下的流体为萃取剂，从液体或固体中萃取药材中的有效成分，并进行分离的方法。最常用的超临界流体是二氧化碳。
第二节 天然产物的分离纯化方法
分离：将提取物中所含的各种成分
一一分开，并将得到的单体加以精制的过程。
一、溶剂分离法
1、采用不同溶剂（极性由小至大）依次抽提
在对药材进行提取时，如果考虑到药材中各种化学成分的性质，则可以采用一种分步提取法，即先使用极性小的溶剂提取药材，以后逐渐增大溶剂的极性。这样，极性小的化学成分被极性小的溶剂所提取，极性大的物质则被极性大的溶剂所提取。
常用的方法是：石油醚→乙酸乙酯→乙醇→水
注意：该过程一般不能逆行操作。
2、酸碱分离法
利用物质在溶液中存在状态不同，溶解度不同的原理。如多数有机酸的盐在水中溶解度较大，而其游离状态的水溶度较小，可通过调节pH值使得这类物质溶解或析出。再如，中药槐花米中含有芦丁，属于黄酮类化合物，因含有酸性较强的酚羟基，易溶于碱性溶液中，当调pH为酸性时，芦丁就会因溶解度降低而析出。本法也可归类为沉淀法。
二、两相溶剂萃取法
1、萃取原理
萃取是利用提取物中各成分在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同而达到分离的方法。
上相
下相
2、连续萃取法
连续萃取法是一种连续的两相溶剂萃取法。该法利用两溶剂比重不同自然分层和分散相液滴穿过固定相溶剂时发生传质。
3、液滴逆流色谱
液滴逆流色谱是在逆流层析法基础上改进的分配色谱技术，流行于上世纪七、八十年代，是一种实验室技术。
4、逆流分溶法
逆流分溶法(Countercurrent distribution，CCD)是一种简单萃取装置的集合体，它集合数百个特制的萃取单元装置于一体，实现了人工所不能达到的数百次萃取过程。使得分离度值较小的两物质也能得到较好的分离。
三、沉淀分离法
醇沉淀法 酸碱沉淀法 铅盐沉淀法
方 式 水提液中加入不同量的乙醇 用酸或碱，调节水溶液的pH值 水或稀醇溶液中加入中性醋酸铅或碱式醋酸铅
适合分离对象 用于蛋白质、多糖、果胶等的初步纯化 用于黄酮类、蒽醌类生物碱类化合物的分离纯化 用于皂苷类、黄酮类和生物碱类成分的初步分离
除 杂 除去树胶、黏液质、蛋白质、淀粉等 除去酸性、中性或碱性杂质 除去多糖、树脂、蛋白质和粘液质等
实 例 天花粉蛋白的分离 蝙蝠葛碱的分离 葛根素的分离
四、盐析法
盐析法是向药材提取液中加入无机盐至一定浓度，或达饱和状态，使某些成分在水中溶解度降低，从而达到与其它物质的分离。
五、透析法
透析法是利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，而大分子物质不能通过半透膜的性质来达到分离的一种纯化方法。
色谱法又称层析法，是分离纯化和定性定量鉴定化合物的有效方法之一，目前应用广泛。近20年来色谱理论逐步发展，实验技术也逐步仪器化、自动化和高速化，目前高效液相色谱的使用已相当普遍，色谱技术已成为化学领域一个重要分离、分析工具。
六、色谱法
色谱法在药物研发和生产上的应用：
1、分离混合物
2、精制化合物
3、鉴别化合物
4、含量测定
第三节
色谱技术在天然药物分离纯化中的应用
色谱技术分类
一、吸附柱色谱
吸附柱色谱（Adsorption chromatography）的原理是利用吸附剂对混合物中各种成分吸附能力的差异和在流动相中溶解度的差异进行分离。
吸附剂 化学结构 表面性质 分 离 对 象
硅 胶 (SiO2)n 微酸性 小分子脂溶性成分如挥发油、苷元、甾类
氧化铝 (Al2O3)n 微碱性 碱性成分如生物碱、胺类
活性炭 非极性 氨基酸、糖、苷类
硅酸镁 酸性
聚酰胺 碱性 酚类和醌类
硅藻土 弱极性 极性稍大的成分如强心苷
1、吸附剂的选择
2、吸附柱色谱的操作
（1）装柱 将选择好的吸附剂通过一定方式装入柱内；
（2）加样 将被分离样品加载到柱顶部，并加少量吸附剂覆盖；
（3）洗脱 将选好的洗脱剂加载于柱顶，打开流出口。
二、分配柱色谱
分配色谱的原理是利用混合物在互不相溶的两相中分配系数不同而将混合物分离开。
正相分配柱色谱：固定相的极性大于流动相，常为水、缓冲液等，适用于极性较大化合物的分离，如苷类、有机酸、糖类等；流动相多为氯仿、乙酸乙酯等弱极性有机溶剂。
反相分配柱色谱：固定相的极性小于流动相，常为硅油和液体石蜡等，用于亲脂性化合物的分离；流动相则为水、甲醇等强极性溶剂。经过化学键合处理的硅胶，表层形成亲脂性表面，稳定性远高于涂布硅油的方式，常用于高效液相色谱，也属反相色谱技术。
3、凝胶过滤色谱
凝胶过滤（Gel filtration）又称为凝胶渗透色谱（Gel permeation chromatography）或分子筛（Molecular sieve filtration），是利用分子筛原理达到物质分离的方法。
四、离子交换色谱
离子交换柱色谱（Ion exchange chromatography）是以离子交换树脂为固定相，以水或含水溶剂为流动相。当样品随流动相流过交换柱时，中性分子、与离子交换基团相反电荷的离子不被交换，随流动相一起流出，但具有与离子交换基团相同电荷的离子则被交换到柱上。交换完毕后，可用适当溶剂将被交换到树脂上的物质洗脱下来，即可达到分离混合物的目的。
交换前，树脂相和提取液中的离子分布情况。
交换后，树脂相和提取液中的离子分布情况。
1. 阳离子交换树脂
含有活泼的酸性基团，能交换阳离子。根据其活性基团解离度的不同，可分为强酸型、弱酸型。强酸型含有强酸性离子交换基团，如磺酸基；弱酸型含有弱酸性交换的离子基团，如羧基。
2. 阴离子交换树脂
含有活泼的碱性基团，能交换阴离子。同样可分为强碱型和弱碱型，强碱型含有强碱性离子交换基团，如季铵型；弱碱型含有弱碱性离子交换基团，如伯氨基型、仲胺型和叔胺型。
离子交换树脂类型
五、大孔吸附树脂
大孔吸附树脂是一类合成高分子材料，具有多孔性和较大的比表面积，因此表现出很好的吸附性能。其分离原理是吸附性和分子筛相结合的原理。大孔树脂在溶剂中可溶胀，可分为非极性、弱极性和中极性等类型。
在水溶液中，大孔吸附树脂对各种物质的吸附性能表现最为突出：非极性树脂对小极性物质的吸附强，极性型树脂对极性化合物的吸附性强。
对被吸附到树脂上的物质进行洗脱时，常采用不同浓度的乙醇溶液进行梯度洗脱，从而达到对不同类别物质的分离。
分离操作：
1、预处理 要清除掉合成时所带来的残留溶剂
2、上样 要适用澄清溶液，以免发生孔径堵塞
3、洗脱 采用乙醇浓度由低到高的梯度洗脱方式
4、再生 采用一定方法去除那些吸附强的物质
六、制备型加压液相色谱
加压液相色谱的原理和分离过程同常规的常压液相色谱一样，不同点在于所使用的填料的粒度更小，粒度范围更窄，分离效率更高。
1—梯度洗脱装置；2—输液泵；3—过滤器；5—色谱柱；6—检测器；7—记录纸；
8—微处理机；9—检测器；10—自动收集装置；11—压力脉动组滞器
思考题
1、从天然药物中提取天然产物的方法主要有哪几种？
2、在天然药物化学成分提取与分离过程中常用有机溶剂的极性强弱顺序是怎样的？
3、溶剂法提取的方式有哪几种？
4、简述各种色谱方法的原理。
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