资源简介

(共42张PPT)
重组DNA技术的基本工具
基因工程
糖尿病是一种常见内分泌疾病，为了治疗糖尿病，有的病人要经常注射胰岛素。如何获取胰岛素？
20世纪20年代，人们开始从猪、牛胰腺中提取胰岛素。但是，从动物胰腺中提取胰岛素成本高、产量低。而且猪胰岛素与人胰岛素有1个氨基酸不同，容易发生免疫反应。
方案1：动物体内提取
日本研究人员将分泌胰岛素的胰岛细胞与拥有增殖能力的干细胞融合到一起,形成一种新细胞,移植到患有重度糖尿病的大鼠体内之后,显著改善了大鼠的症状。
方案2：人工合成
方案3：动物细胞融合技术
1965年，世界上第一个人工合成的蛋白质——牛胰岛素在中国诞生，这是世界上第一次人工合成与天然胰岛素分子相同化学结构并具有完整生物活性的蛋白质。
方案4：发酵工程
利用 大肠杆菌生产人的胰岛素。
转基因
方案可行么？理论基础？
人的胰岛素基因
大肠杆菌
剪切
拼接
导入
表达
载体
检测鉴定表达产物
人的组织细胞
提取
研究过程中遇到了困惑：切割后的DNA片段往往不能进行复制并很容易在细胞中降解。
Herbert Wayne Boyer
（具备在受体细胞中独立复制性能的 DNA 分子）
【问题1】胰岛素基因能够进入大肠杆菌么？该变异可以遗传么？
基因工程——诞生的理论基础
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
理论基础
1.DNA的基本组成单位相同(都是四种脱氧核苷酸)
2.都遵循碱基互补配对原则
3.DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构
理论基础
1.基因是控制生物性状的结构与功能单位
2.遗传信息传递都遵循中心法则
3.生物界几乎共用一套遗传密码
【问题2】为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？
【问题3】为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？
基因工程——诞生的理论基础
基因工程
基因工程是指在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，将外源目的基因与载体DNA进行组合形成重组DNA，然后导入受体细胞，并使其在受体细胞中表达，产生人类需要的基因产物的技术。
归纳定义 工程别名 重组DNA技术 转基因技术
操作环境 生物体外
操作对象 基因
操作水平 DNA分子水平
基本过程 剪切→拼接→导入→表达
原理 基因重组
基因工程
分子运输车
分子手术刀
分子缝合针
DNA分子直径只有2nm,要想实现这样一个精确的过程，我们应该选择具有什么功能的工具来对DNA分子进行操作呢
5’
3’
3’
5’
② 和 交替连接，排列在外侧，构成 ； 排列在内侧。
③两条链上的碱基通过 连接成碱基对，且遵循 。
①DNA是由两条单链组成的，这两条链按 方式盘旋成双螺旋结构。
反向平行
脱氧核糖
磷酸
碱基
基本骨架
氢键
碱基互补配对原则
回顾——DNA
磷酸二酯键
…… ATGCCGTGGAATTCC ……
…… TACGGCACCTTAAGG ……
①
②
磷酸二酯键
氢键
01
“分子手术刀”
带32P放射性标记的病毒
侵染未标记的细菌
没有病毒释放
没有在细菌中检测到放射性DNA
推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么
切割外源DNA使之失效，从而达到保护自身的目的。
推测未能检测到放射性的原因
保温一段时间
推测：该菌具有剪切外源DNA作用的酶。
史密斯
限制性内切核酸酶
或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。
EcoR Ⅰ 识别的序列？催化断开的化学键？
EcoRⅠ
EcoR Ⅰ酶切形成的末端都一样，说明限制酶的作用有什么特点？
5’
3’
5’
3’
5’
3’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
01
限制性内切核酸酶----“分子手术刀”
EcoRⅠ：大肠杆菌（Escherichia coli）R型菌株中分离出的第一个限制酶。
EcoR Ⅰ
种加词头两个字母
菌株型号
数字表示分离出来的第几种限制酶
属名首字母
01
　
黏性末端　　　　
黏性末端
只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。
被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。
EcoR I 限制酶的切割：
01
限制性内切核酸酶----“分子手术刀”
Hind Ⅲ
Sma Ⅰ
Xma Ⅰ
BamH Ⅰ
Bgl Ⅱ
5’…GAATTC…3’
3’…CTTAAG…5’
5’…CCCGGG…3’
3’…GGGCCC…5’
5’…GGATCC…3’
3’…CCTAGG…5’
5’…AGATCT…3’
3’…TCTAGA…5’
5’…CCCGGG…3’
3’…GGGCCC…5’
识别序列都可以找到一条中轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，称为回文序列，即在切割位点，DNA一条链和它的反向互补链的序列一样。
图中为限制酶识别位点，三角标示酶切位置。观察不同限制酶的识别序列，分析限制酶的识别序列在碱基的排列顺序上有什么特点
Hind Ⅲ
Sma Ⅰ
Xma Ⅰ
BamH Ⅰ
Bgl Ⅱ
5’…GAATTC…3’
3’…CTTAAG…5’
5’…CCCGGG…3’
3’…GGGCCC…5’
5’…GGATCC…3’
3’…CCTAGG…5’
5’…AGATCT…3’
3’…TCTAGA…5’
5’…CCCGGG…3’
3’…GGGCCC…5’
5’…G
3’…CTTAA
AATTC…3’
G…5’
5’…CCC
3’…GGG
GGG…3’
CCC…5’
5’…C
3’…GGGCC
CCGGG…3’
C…5’
5’…G
3’…CCTAG
GATCC…3’
G…5’
5’…A
3’…TCTAG
GATCT…3’
A…5’
1.所有限制酶的切割结果都是黏性末端
2.有没有哪些限制酶的切割产生了相同的黏性末端？
思考：
01
限制性内切核酸酶----“分子手术刀”
主要来自原核生物
数千种
限制酶不是一种酶，而是一类酶。
来源
种类
特点
能识别双链 DNA 分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
作用部位
识别序列长度
特定切点上的磷酸二酯键
大多数是6个核苷酸序列
结果
产生黏性末端或平末端
01
限制性内切核酸酶----“分子手术刀”
胰岛素基因
TAGGATCCGCGAATTCTT
ATCCTAGGCGCTTAAGAA
TCCGAATTCCAAGCTT
AGGCTTAAGGTTCGAA
请用剪刀模拟EcoRI的识别序列和切割位点将目的基因“切割”下来。
要想获得某个特定性状的目的基因必须要用限制酶切几个切口？
可产生几个黏性(平)末端？
要切2个切口，产生4个黏性(平)末端。
5’…
…5’
…3’
3…
识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。
GAATTC
CTTAAG
02
限制性内切核酸酶----“分子手术刀”
怎样把切割下来的胰岛素基因和环形DNA载体连接起来？
缺口怎么办？
这两个片段之间能连上么？
切割载体的限制酶有什么要求？
02
A A T T G
C
A
A
T
T
A
A
T
T
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶？
02
“分子缝合针”
推测：自然界中存在一种酶能将断开的DNA连接起来么？
作用：将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端。
02（1）E.coliDNA连接酶或T4DNA连接酶连接黏性末端02DNA连接酶---- “分子缝合针”可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，
02
（2）T4 DNA连接酶连接平末端
02
DNA连接酶 ---- “分子缝合针”
T4 DNA连接酶黏性末端与平末端均可连接，但连接平末端的效率相对比较低。
将双链 DNA双链片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 。
作用
02
DNA连接酶 ---- “分子缝合针”
名称 作用部位 作用结果（反应物——产物）
限制酶 磷酸二酯键 将DNA切成两个片段
DNA连接酶 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
解旋酶 碱基对之间 的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链，
形成两条长链
归纳总结
几种相关酶的比较
1.限制酶的作用特点、结果 体现了酶的什么特性 两种DNA连接酶的区别
且目的基因与载体用什么切割后，通过什么连接从而形成基因表达载体
2.限制酶和DNA解旋酶，DNA 连接酶、DNA 聚合酶的作用部位的区别？
如何连接DNA的平末端
3.基因工程的原理 基因工程常用的工具酶
4.画出下边3种酶切割后的末端
—GAATTC—
—CTTAAG—
—AATT—
—TTAA—
—GGGCCC—
—CCCGGG—
3.某质粒上有3个限制酶A识别位点,如图所示。用一定量的限制酶A短暂处理足量的该质粒后电泳分离。在凝胶中DNA分子的迁移速率与DNA分子的大小和构象等有关,则可得电泳条带数目是 (　　)
A.7　　　　B.8　　　　C.9　　　　D.10
一段DNA被多种限制性核酸内切酶进行切割，通过电泳对其进行分离,获得的数据如下:
(1)起始DNA是线状的还是环状的
(2)绘制一幅酶切位点图,同比例反映上述数据。
酶 片段数量 片段大小（kb）
EcoR Ⅰ 2 1.5kb
1.5kb
Hind Ⅲ 1 3.0kb
EcoR Ⅰ+Hind Ⅲ 3 0.8kb
0.7kb
1.5kb
尝试把载体酶切后，将载体和目的基因连接。
思考实际连接中还可能出现哪些连接方式？
02
DNA连接酶 ---- “分子缝合针”
需要的
重组质粒
目的基因
和质粒环化
目的基因
和质粒环化
目的基因
质 粒
目的基因
和质粒环化
两目的基因
环化
两质粒
环化
质 粒
自我环化
目的基因
自我环化
尝试把载体酶切后，将载体和目的基因连接。
02
DNA连接酶 ---- “分子缝合针”
连出来的重组DNA一样么？
思考：
对基因工程操作有什么影响？
如何改进酶切，才能让目的基因与载体正确相连？
02
DNA连接酶 ---- “分子缝合针”
目的基因
质粒
目的基因
需要的
重组质粒
目的基因
和质粒环化
两目的基因
环化
两质粒
环化
质 粒
自我环化
目的基因
自我环化
两质粒
环化
两目的基因
环化
目的基因
和质粒环化
单酶切的问题：
目的基因、质粒的自身环化
目的基因与质粒反向连接
双酶切法：即在基因工程中使用2 种限制酶分别切割目的基因的两端，同时用上述2种限制酶切割质粒，然后用DNA 连接酶连接，以获得所需要重组质粒。
目的基因
质 粒
质粒长片段和
目的基因环化
两目的
基因环化
质粒短片段
和目的
基因环化
两质粒
短片段环化
两质粒
长片段环化
需要的
重组质粒
02
DNA连接酶 ---- “分子缝合针”
03
基因进入受体细胞的载体----“分子运输车”
作用
将目的基因转入受体细胞&在受体细胞内对目的基因进行大量复制
种类
质粒
动植物病毒
噬菌体（λ噬菌体的衍生物）
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。质粒可以在细菌之间转移,从而使其他本不耐药的细菌获得耐药性。
质粒
03
基因进入受体细胞的载体----“分子运输车”
载体的作用有哪些？
1.作为运载工具，将目的基因转移到受体中
2. 利用载体在受体细胞内，对外源基因进行大量复制，使目的基因在受体细胞中能够表达和发挥作用
分别写出DNA聚合酶、限制酶、解旋酶、DNA连接酶作用部位和作用结果。
写出运载体需要具备的条件。（4个）
写出两种DNA连接酶的名称及其对应的连接末端。
写出DNA的基本单位的名称并画出DNA基本单位的结构，标注五碳糖上五个碳原子的编号。
写出运载体的三种类型。
03
基因进入受体细胞的载体----“分子运输车”
便于插入（携带）目的基因
运载体需具备的条件
①能在受体细胞中稳定保存并复制
②有一个至多个限制酶切割位点
③具有标记基因，便于筛查含有重组DNA分子的细胞（抗生素抗性基因、具有颜色反应的基因）
④对受体细胞无害
真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
大肠杆菌及质粒结构模式图
03
基因进入受体细胞的载体----“分子运输车”
载体上标记基因的标记原理
普通培养基
不含抗生素
选择培养基
50 g/ml四环素
人的胰岛素基因
大肠杆菌
剪切
拼接
导入
表达
载体
检测鉴定表达产物
人的组织细胞
提取
（具备在受体细胞中独立复制性能的 DNA 分子）
基因工程——诞生的理论基础
选择质粒酶切位点时有什么要求？
保留复制起点
至少保留一个标记基因
限制酶
DNA连接酶
载体
①对受体细胞无害；
②有一个至多个限制酶切割位点；
③有特殊的标记基因；
④能自我复制或能整合到宿主DNA上。
质粒、噬菌体 、动植物病毒
基因工程的基本工具
作为载体的条件
种类：
磷酸二酯键
来源：
主要来源于原核生物
特点：
作用部位：
具有专一性
结果：
形成黏性末端或平末端
连接部位：磷酸二酯键
种类： E.coliDNA连接酶、T4 DNA连接酶
作用： 把两条双链DNA片段拼接起来
小结
1．基因工程的原理是基因重组，此变异是定向的。(　)
2．DNA聚合酶也可以用作DNA重组技术的工具。(　)
4．不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端相同。(　)
5．DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端。(　)
6．载体的种类有质粒、噬菌体、动植物病毒等，其中动植物病毒必须是DNA病毒。(　)
√×√× √
1.下面哪项不具有限制酶识别序列的特征（ ）
A．GAATTC B．GGGGCCCC C．CTGCAG D．CTAAATC
CTTAAG CCCCGGGG GACGTC GATTTAG
D
2.下图表示三种黏性末端，下列说法正确的是
C
A．乙中的酶切位点在A与G之间
B．甲、乙、丙由两种限制酶作用产生
C．若甲中的G处发生突变，限制酶可能无法识别该切割位点
D．限制性核酸内切酶作用于碱基对之间的氢键
如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制酶、
DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是(　　)
A．①②③④ B．①②④③ C．①④②③ D．①④③②
C
【反馈练习】
02
DNA连接酶 ---- “分子缝合针”
根据所学知识，完成以下填空：①限制酶 ②解旋酶 ③DNA连接酶 ④DNA聚合酶 ⑤RNA聚合酶baA.切断a处的酶为_______B.连接a处的酶为_______C.切断b处的酶为_______①③④②⑤a：磷酸二酯键；b：氢键某线性DNA分子含有5000个碱基对（bp），先用限制酶 a 完全切割，产物再用限制酶b完全切割，得到的DNA片段大小如下表。限制酶a和b 的识别序列和切割位点如下图所示。下列有关叙述错误的是：
D
A．酶a与酶b切断的化学键相同
B．该DNA分子中酶a能识别的碱基序列有3处
C．仅用酶b切割该DNA分子可能得到三种DNA片段
D．酶a和酶b切出的DNA片段不能相互连接
酶a切割产物（bp） 酶b再次切割产物（bp）
2100,1400, 1000,500 1900,200,800,600,
1000,500
酶a切割位点
线性DNA分子
酶b切割位点
酶a切割后末端: 酶b切割后末端:
—A GATCT — —G GATCC —
— TCTAG A — —CCTAG G —
酶a切割产物（bp） 酶b再次切割产物（bp）
2100,1400, 1000,500 1900,200,800,600,
1000,500
2100 1400 1000 500
1900 200 800 600 1000 500
1.DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是（ ）
A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键
B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D.只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端
2.在重组DNA技术中,将外源基因送入受体细胞的载体可以是 （ ）
A.大肠杆菌的质粒 B.切割DNA分子的酶
C.DNA片段的黏性末端 D.用来识别特定基因的DNA探针
C
A
01平末端　　　平末端01限制性内切核酸酶----“分子手术刀”

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