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是指应用细胞生物学、分子生物学和发育生物学等多学科的原理和方法，通过细胞器、细胞或组织水平上的操作，有目的地获得特定的细胞、组织、器官、个体或其产品一门综合性的生物工程。根据操作对象的不同，可以分为植物细胞工程和动物细胞工程两大领域。
一、细胞工程
细胞工程
植物细胞工程
动物细胞工程
植物组织培养技术
植物体细胞杂交技术
动物细胞培养
动物细胞融合技术与单克隆抗体
动物细胞核移植技术
克隆动物
一、动物细胞培养
1.动物细胞培养概念：指从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适
宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。2.动物细胞培养的原理：细胞增殖（有丝分裂）。3.动物细胞培养的地位：动物细胞工程的基础。
4.动物细胞培养条件
糖类、氨基酸、无机盐、维生素……
无菌、无毒的环境
适宜的温度、pH和渗透压
适宜的气体环境
（1）营养
动物细胞在体外培养时，培养基中应含有细胞所需要的各种营养物质。在使用合成培养基培养动物细胞时，通常需加入血清等一些天然成分。
（2）无菌、无毒环境
（3）温度、PH和渗透压
哺乳动物细胞培养的温度多以36.5±0.5℃为宜。多数动物细胞生存的适宜pH为7.2-7.4。维持适宜渗透压的目的维持细胞正常的形态和功能。
（4）气体环境（O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用维持培养液的pH。）
通常采用培养皿或松盖培养瓶进行培养。
培养方法：将动物细胞置于气体环境为95%空气和5%CO2的CO2培养箱中进行培养。
（1）对培养液和所有培养用具进行灭菌处理；
（2）在无菌环境下进行操作（可根据实际情况适量添加抗生素）
（3）定期更换培养液
清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。
无菌
无毒
动物细胞培养的过程
取动物组织
分散成单个细胞
解决
悬浮生长
贴壁生长
(大多数）
细胞密度过大、有害代谢物积累、营养物质缺乏等
接触抑制
传代培养
用机械法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理
细胞悬液
原代培养
分瓶
培养
①原代培养：指动物组织经处理后的初次培养。
②细胞贴壁：某些细胞需要贴附于某些基质表面才能增殖，这类细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上。
③接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞停止分裂增殖的现象。
④传代培养：分瓶后的细胞培养。
加培养液
在培养皿或培养瓶内
悬浮培养的细胞:直接用离心法收集
贴壁细胞:用胰蛋白酶处理分散成单个细胞，用离心法收集
细胞分裂受阻
②制成细胞悬液，分瓶培养
①收集细胞
二
注意2：培养前把细胞分散成单个细胞的原因是：①成块组织中细胞与细胞靠在一
起，彼此限制了生长与增殖；②利于与培养液充分接触，保证O2与营养供
应和代谢物及时排出。
注意3：进行动物细胞培养时常用胰蛋白酶分散细胞，这说明细胞间的物质主要是蛋白
质。胰蛋白酶不能换成胃蛋白酶，原因是多数动物细胞培养的适宜pH为7.2～
7.4，胃蛋白酶在此环境中没有活性，所以用胃蛋白酶不行。
注意1：动物细胞培养时，应该选择动物胚胎或幼龄动物的组织、器官，原因是细
胞分化程度低，分裂能力强，容易培养。
注意4：细胞膜的成分中含有蛋白质，而胰蛋白酶能够水解蛋白质，因此，胰蛋白酶
会把细胞消化掉。所以胰蛋白酶处理的时间不能太长。
注意5：细胞贴壁的条件是培养瓶或培养皿内表面光滑、无毒、易于贴附。
注意6：正常细胞有接触抑制的现象，
思考1.为什么要进行分瓶培养？
分瓶培养
(传代培养)
解决
接触抑制
细胞密度过大
有害代谢物积累
营养物质缺乏
思考2:进行传代培养(分瓶培养)时，如何处理？
离心法收集
胰蛋白酶处理
制成细胞悬液
分瓶培养
悬浮细胞
贴壁细胞
区分两种“培养”的关键是看用胰蛋白酶处理的对象。
①第一次：用胰蛋白酶对剪碎的动物组织进行处理，使其分散成单个细胞后进行培养，为原代培养。
②第二次：细胞培养过程中出现接触抑制，用胰蛋白酶使其从瓶壁上脱离下来，然后，将其分散到多个培养瓶中继续培养，为传代培养。
传代培养
10代以内：保持正常 （可 保存）；
10～50代：增殖逐渐缓慢，以致于 ，部分细胞 可能发生变化；
大于50代：发生 ，获得 性，等同 。
二倍体核型
冷冻
完全停止
核型
突变
不死
癌细胞
传代培养：
像这样，将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。
细胞株
从原代培养细胞群中筛选出进行传代培养的细胞，能传到40-50代，其遗传物质没有发生变化。
细胞系
传到40-50代后有部分细胞遗传物质发生了变化，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，可能在培养条件下无限制的传代下去。
细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。
区别：
1.干细胞的概念：
动物和人体内仍保留的少数具有分裂和分化能力的细胞。在一定条件下，干细胞可以分化成其他类型的细胞。
2.干细胞的分布：
干细胞存在于_________、_____和_______等多种组织和器官中；
早期胚胎
骨髓
脐带血
3.干细胞的分类：
包括胚胎干细胞和成体干细胞等。
（1）胚胎干细胞（简称ES细胞）
①分布：
存在于______________中
早期胚胎
②特点：
具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步
形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能
③应用实例：
ES细胞在体外分化成心肌细胞、神经元细胞和造血干细胞等
三、干细胞培养及其应用
骨髓中的__________、神经系统中的_________、睾丸中的____________等；
（2）成体干细胞
①分布：
存在于________________中
成体组织或器官内
②举例：
造血干细胞
神经干细胞
精原干细胞
③特点：一般认为，成体干细胞具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，
不具有发育成完整个体的能力。
④发现最早、研究最多的、应用最成熟的实例：_____________
主要存在于成体的_____、_______和________中
造血干细胞
骨髓
外周血
脐带血
根据全能性大小可分为：全能干细胞、多能干细胞、专能干细胞。
全能干细胞：胚胎干细胞
多能干细胞：造血干细胞
专（单）能干细胞：
上皮基底层干细胞 　成肌干细胞　 神经元干细胞
上皮细胞
神经细胞
肌细胞
治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）
治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病
有着自我更新能力及分化潜能的干细胞，与组织、器官的发育、再生和修复等密切相关。
4.干细胞的应用
（1）应用原理：
（2）应用实例：
造血干细胞：
神经干细胞：
干细胞将在再生医学、药物安全性与有效性检测等领域发挥大作用。
（3）面临的问题：
存在导致肿瘤发生的风险
（4）应用展望：
5.诱导多能干细胞（iPS细胞）
（1）胚胎干细胞的局限性：
胚胎干细胞必须从_____中获取 ，涉及________,因而限制了在医学上的应用。
胚胎
伦理问题
（2）诱导多能干细胞概念：
通过体外诱导小鼠成纤维细胞，获得了类似胚胎干细胞的一种细胞，称为诱导多能干细胞，简称iPS细胞。
诱导方法：
①将特定基因或特定蛋白导入细胞（成纤维细胞以及已分化的T细胞、
B细胞均可）；
②用小分子化合物诱导形成。
（3）诱导多能干细胞优点：
①诱导过程无须破坏胚胎；
②iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应。
移植
取成纤维细胞等
iPS细胞
转入相关因子
细胞发生转化
分化
胰岛细胞
神经元
血细胞
肠上皮细胞
心肌细胞
肝细胞
病人
iPS细胞用于治疗人类疾病示意图
（4）诱导多能干细胞的应用：
可治疗镰状细胞贫血症，在治疗阿尔兹海默病、心血管疾病等领域的研究也取得了新进展
1、定义： 动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵
母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体。
2、原理： 动物细胞核具有全能性、细胞膜具有一定的流动性
3、分类： 胚胎细胞核移植、 体细胞核移植。
胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易。
动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难
4、应用：
用核移植的方法得到的克隆动物动物
三、动物细胞核移植
5.过程（以克隆奶牛为例）
细胞核移植
卵巢卵母细胞(受体)
去核 MⅡ中期
去核卵母细胞
供体体细胞（供体）
供体细胞
细胞培养
注入
重组细胞
细胞融合
生下与供体遗传物质基本相同的个体
重组胚胎
用物理法或化学法激活受体细胞，使其完成发育
动物细胞培养
代孕母体的子宫
胚胎移植（桑椹胚或囊胚）
早期胚胎培养
胚胎移植
一
动物细胞融合
动物细胞培养
AA、AB、BB
四、动物细胞融合技术
1.概念：
使____或_____动物细胞结合形成____细胞的技术。
2.结果：
形成的________具有原来两个或多个细胞的_________。
3.原理：
4.诱导融合方法：
有 等。
两个
多个
一个
杂交细胞
遗传信息
细胞膜具有一定的流动性
电融合法、PEG融合法、灭活病毒诱导法
5.意义：
突破了 的局限，使 成为可能。
有性杂交
远缘杂交
是动物细胞融合特有的诱导融合方法
五、单克隆抗体
1.传统抗体的获得
向动物体内反复注射某种抗原，从动物血清中分离所需抗体
产量低、纯度低、特异性差
(2)缺点：
(1)方法:
产抗体，不能无限增殖。
动物体内
抗原
刺激
浆细胞
抗体
B细胞
增殖分化
抗原不纯
抗体不纯
2.单克隆抗体的制备
(1)单克隆抗体的概念:
单个细胞
无性繁殖
化学性质单一，特异性强
单：
克隆：
抗体：
由单个B淋巴细胞（浆细胞）经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。
每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体
单一B淋巴细胞
细胞群
选择
克隆
产生
大量纯度高特异性强的抗体
B淋巴细胞不可能无限增殖
(2)B淋巴细胞（浆细胞）的特点:
如何解决这一难题？
癌细胞能无限增殖，但不能产生抗体
(3)单克隆抗体的制备思路
一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体
骨髓瘤细胞（癌细胞）能无限增殖
动物细胞融合
杂交瘤细胞
动物细胞培养
单克隆抗体
杂交瘤细胞：既能迅速大量增殖，又能产生抗体
1984年获得了诺贝尔生理学或医学奖
米尔斯坦 （英国）
科勒
（德国）
(4)制备过程：
多种B细胞
培养骨髓瘤细胞
骨髓瘤细胞
将骨髓瘤细胞和B细胞融合
多种杂交细胞
诱导融合
能产生抗体，
但不能大量增殖
不能产生抗体，但能大量增殖
瘤-瘤、B-B、 B-瘤
注射特定的抗原
用特定的抗原免疫，从小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞。
融合的方法？融合后，融合细胞几种类型？（只考虑两两融合）
（多种）杂交瘤细胞
（既能迅速大量增殖，又能产生抗体）
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞（分泌的抗体能和特定的抗原结合）
注射到小鼠腹腔内
体外培养
单克隆抗体
第一次筛选：
用特定的选择培养基进行筛选：在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。
第二次筛选：对选择培养的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选，就可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。
从细胞培养液或小鼠腹水中获取大量的单克隆抗体
将抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞在体外大规模培养或者注射小鼠腹腔中增值
培养杂交瘤细胞的方法比较
项目 腹腔培养 体外培养
优点
缺点
易于控制培养条件（如无需提供无菌环境等），操作简单，成本较低
规模小，产量少
可大规模培养，大量生产
需要人为控制培养条件，成本相对较高
←B淋巴细胞及同型融合细胞
←骨髓瘤细胞及同型融合细胞
←杂交瘤细胞
思考：如何进行第一次筛选获得多种杂交瘤细胞？
①已知细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。
②人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不能分裂增殖。
③鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径，但能不断分裂增殖。
筛选出杂交瘤细胞方法？
不能无限增殖，死亡
不能无限增殖，死亡
能无限增殖，生长
培养基中加入氨基嘌呤
HAT培养基
如何进行第二次筛选获得能分泌所所需抗体的杂交瘤细胞？
将杂交瘤细胞群稀释后滴入多孔板，约每孔1个细胞进行培养（克隆化培养）
一段时间后，用标记的抗原检测各孔上清液中细胞分泌的抗体
上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔
分泌抗体能跟特定抗原结合的细胞即为所需杂交瘤细胞
多孔细胞培养板
阳性孔
抗体检测板
多次克隆化培养以及有限稀释法
抗原-抗体杂交(分子水平的鉴定）
抗体检测原理：
(1)该过程中应用到的技术：
(2)原理：
(3)注射特定抗原的目的：
(4)诱导融合的方法：
动物细胞特有的为______________
(5)比较两次筛选的不同：
(6)杂交瘤细胞的特点：
(7)如何获取大量所需杂交瘤细胞？
(8)如何获取单克隆抗体：
动物细胞融合、动物细胞培养
细胞增殖细、胞膜具有一定的流动性
用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞
PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法
灭活病毒诱导法
既能迅速大量繁殖，又能产生抗体
在体外培养或注射到小鼠腹腔内增殖
从细胞培养液中获取或从小鼠腹水中获取
（4）小结：单克隆抗体的制备
(1)能准确地识别抗原的细微差异;
(2)与特定抗原发生特异性结合;
(3)可以大量制备。
3.单克隆抗体的优点：（特异性强、灵明度高、可大量制备）
六、单克隆抗体的应用
(1)作诊断试剂——应用最广泛
实例：利用同位素或荧光标记的单克隆抗体在特定组织中成像的技术，可定位诊
断肿瘤、心血管畸形等疾病。
优点：准确、高效、简易、快速。
资料1.用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的"早早孕诊断试剂盒"，在妊娠第8天就可以作出诊断，这比原来的诊断方法提前了10d左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。
(2)运载药物
抗体-药物偶联物（ADC）通过将 与能特异性识别肿瘤抗原的 结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由_____、______和______三部分组成。
单克隆抗体
细胞毒素
抗体
接头
药物
优点：位置准确、疗效高、副作用小
“生物导弹”
=单克隆抗体＋放射性同位素
或＋化学药物
或＋细胞毒素
单抗导向，药物为弹头
靶向运输作用
ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。
(3)作为药物治疗疾病
单克隆抗体单独使用，也可直接用于治疗疾病

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