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第二节 微生物的培养技术及应用
（一）
向经过杀菌处理的牛奶中添加某些对人体有益的细菌，再经过发酵就可以制成酸奶，由于制作工艺并不复杂，一些人会在家里自制酸奶，自制酸奶虽然方便，但是食用自制酸奶导致肠胃不适的事件屡见不鲜，主要原因是在制作过程中有杂菌混入。那么，怎样才能保证无处不在的杂菌不混入发酵物中呢？
从社会中来
提示：应该先对制作用具和原料进行灭菌处理，再接种纯的菌种，并控制发酵条件，避免杂菌进入。
一、微生物的基本培养技术
发酵工程的基础
防止杂菌污染，获得纯净的微生物培养物是研究和应用微生物的前提，也是发酵工程的重要基础。
微生物培养的前提条件
一方面要为人们需要的微生物提供合适的营养和环境条件；
另一方面要确保其他微生物无法混入，并将需要的微生物分离出来。
相关信息
微生物是难以用肉眼观察的微小生物的统称，包括细菌、真菌、病毒及一些原生生物等。
本章提及的微生物主要是指用于发酵的细菌和真菌。
（一）培养基的配制
1、培养基的概念
2、 培养基的作用
3、培养基的分类
4、固体培养基培养微生物的结果
5、培养基的成分
6、牛肉膏蛋白胨培养基的组成
7、培养基配制的其他要求
1、培养基的概念
人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质，就是培养基。
2、培养基的作用
用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
3、培养基的分类
分为加入凝固剂（如琼脂）、呈液体状态的液体培养基和呈固体状态的固体培养基。
液体培养基中加入琼脂后成为固体培养基。
液体培养基主要用于扩大培养、工业生产；固体培养基主要用于微生物的分离、计数、鉴定等。
微生物在琼脂固体培养基表面或内部生长，可以形成肉眼可见的菌落（colony）。一个菌落一般由一个微生物繁殖而来。
4、固体培养基培养微生物的结果
液体培养基
固体培养基
5、培养基的成分
虽然各种培养基的配方不同，但一般都含有水、碳源（提供碳元素的物质）、氮源（提供氮元素的物质）和无机盐等营养物质。
旁栏思考：为什么培养基需要氮源？
氮元素是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的。
6、牛肉膏蛋白胨培养基的组成
1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的营养组成 组分 含量 提供的主要营养
牛肉膏 5g 碳源、磷酸盐和维生素等
蛋白胨 10g 氮源和维生素等
NaCl 5g 无机盐
H2O 定容至1000ml 水
7、培养基配制的其他要求
在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。
微生物例子 培养基需要的特殊物质或条件
乳酸杆菌 添加维生素
霉菌 调至酸性
细菌 调至中性或弱碱性
厌氧微生物 提供无氧的条件
（二）无菌技术
1、无菌技术的意义和目的
2、 消毒和和灭菌
3、无菌操作的场所
1、无菌技术的意义和目的
获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染。
无菌技术应围绕着如何避免杂菌的污染展开，主要包括消毒和灭菌。
2、 消毒和灭菌
消毒是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法，杀死物体表面或内部一部分微生物。
灭菌是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有微生物，包括芽孢和孢子。
（1）概念
（2）应用场景
对操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。
将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。
（3）方法
消毒 灭菌
常用方法 煮沸消毒法 巴氏消毒法 化学药剂消毒法 紫外线消毒法 灼烧灭菌法
湿热灭菌法
干热灭菌法
消毒的方法
①煮沸消毒法： 100℃煮沸5-6min。
②巴氏消毒法： 62-65℃下煮30min 或 80-90℃下煮30s-1min。
③化学药剂消毒法：用70%酒精擦拭双手；氯气消毒水源。
④紫外线消毒法：
用紫外灯照射接种室、接种箱、超净工作台
①湿热灭菌
这是一种利用沸水、流通蒸汽或高压蒸汽进行灭菌的方法。其中高压蒸汽灭菌的效果最好。实验室常用的高压蒸汽灭菌锅就是以水蒸气为介质，在压力为100 kPa、温度为121 ℃的条件下，维持15～30min来灭菌的。
灭菌的方法
②干热灭菌
将灭菌物品放入密闭容器如干热灭菌箱，在160~170 ℃的热空气中维持2~3 小时可以达到灭菌的目的。耐高温的和需要保持干燥的物品，如玻璃器皿（如吸管、培养皿等）、金属用具等，可以采用这种方法灭菌。
③灼烧灭菌
将微生物的接种工具，如涂布器、接种环、接种针或其他金属用具，直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌。此外，在接种过程中，试管口、瓶口等容易被污染的部位，也可以通过火焰灼烧来灭菌。
3、无菌操作的场所
做好消毒和灭菌工作后，要注意避免已经灭菌的材料用具与周围物品接触。为了避免周围环境微生物污染，操作应在超净工作台并在酒精灯火焰旁进行。
（三）微生物的纯培养
1、纯培养的概念
2、纯培养的步骤
3、酵母菌的纯培养
1、纯培养的概念
在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为培养物。
由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。
2、纯培养的步骤
配置培养基→灭菌→接种→分离→培养
3、酵母菌的纯培养
（1）原理
（2）材料用具
（3）方法步骤
（4）结果分析与评价
分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。
采用平板划线法和稀释涂布平板法将单个微生物分散在固体培养基上，之后得到的单菌落一般是由单个微生物形成的纯培养物。
在马铃薯琼脂培养基上进行酵母菌的纯培养。
（1）原理
（2）材料用具
酵母菌培养液、马铃薯、葡萄糖(或蔗糖)、琼脂、蒸馏水、天平、小刀、纱布、烧杯、锥形瓶、棉塞、牛皮纸(或报纸)、皮筋、培养皿、接种环、酒精灯、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、干热灭菌箱和恒温培养箱等。
A、配制培养基
称取去皮的马铃薯 200 g，切成小块，加水 1 000 mL，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入 20 g葡萄糖(也可用蔗糖代替)， 15 ~ 20 g 琼脂，用蒸馏水定容至 1 000 mL。
B、灭菌
将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞,包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为 100 KPa、温度为 121℃的条件下，灭菌 15 ~ 30 min。将 5 ~ 8 套培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在 160 ~ 170 ℃灭菌 2h。
（3）方法步骤
①配制培养基
C、倒平板
待培养基冷却至50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。倒平板的具体操作步骤如下。
②接种和分离酵母菌
通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。经数次划线后培养，可以分离得到单菌落。平板划线的具体操作见下面的流程图。
平板划线法注意事项:
①接种环只蘸一次菌液，但要在培养基不同位置连续划线多次。
②划线时最后一区域不要与第一区域相连。
③每次划线前接种环进行灭菌，最后一次划线结束后，也要灼烧接种环。
④划线后，培养皿倒置培养。
⑤划线用力要大小适当，防止用力过大将培养基划破。
⑥灼烧后的接种环，要冷却后才能继续操作，以免温度太高杀死菌种。
⑦在实验室中，切不可吃东西、喝水，离开实验室时一定要洗手，以防止被微生物感染。使用后的培养基在丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境。
③培养酵母菌
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入 28℃ 左右（培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异）的恒温培养箱中培养 24 ~ 48h。
（4）结果分析与评
1.未接种的培养基表面是否有菌落生长，如果有，说明了什么？
2.在接种酵母菌的培养基上，你是否观察到了菌落？这些菌落的颜色、形状、大小是否一致，如果你观察到了不同形态的菌落，你能分析可能是哪些原因引起的吗？
在未接种的培养基表面应该没有菌落生长，如果有，说明培养基被杂菌污染。
如果观察到了不同形态的菌落，可能是接种的菌种不纯或无菌操作不规范等原因引起的。
评估论点的可信程度
有一段时间，水果“酵素”风靡各地。水果“酵素”制作的大致过程是：将洗净、切成块状的水果放入洁净的容器，再加入糖和水,密封，置于阴凉处发酵一至两周。有人说，吃水果“酵素”可以美容、减肥、促进消化和提高免疫力。请评估这一论点是否可信。追问以下问题可以帮助你分析。
“酵素”是什么？水果“酵素”的制作原理是什么？水果“酵素”中可能含有哪些成分？它是否含有人们无法从其他食品中获取但又是维护健康所必需的成分？水果“酵素”中的所有成分都有益于人体健康吗？
如果要更加有力地支持或反驳水果“酵素”有益健康的论点，应该怎样获取证据？
所谓“酵素”，就是“酶”的另一种说法。“酵素”制作就是利用微生物进行无氧呼吸的原理，进行像制作泡菜一样的发酵。 这样制作的“酵素”中可能有糖类(包括-些简单的糖和膳食纤维等)、蛋白质(包括多种酶)、有机酸等成分，不存在它独有的、特殊的营养物质，其中甚至可能含有微生物发酵产生的有毒物质，食用后可能会危害人体健康。因此，“吃水果酵素可以美容、减肥、促进消化和提高免疫力”的论点值得怀疑。
评估论点的可信程度
帮范儿
再会

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