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第二节 微生物的培养技术及应用
（二）
二、微生物的选择培养和计数
自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合的菌群中不是优势种群时，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。
该怎么办呢？
（一）选择培养基
1、Taq酶的筛选
2、 实验室微生物筛选的原理
3、选择培养基
4、思考讨论
1、Taq酶的筛选
1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌，进而从这种菌中提取出耐高温的DNA聚合酶 （Taq酶）。
聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外扩增DNA片段的技术，此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。
筛选原因：水生栖热菌能在70-80℃高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
美国黄石公园
2、 实验室微生物筛选的原理
实验室中微生物的筛选，也可以应用同样的原理，即人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。
3、选择培养基
选择培养基配方的设计
尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可以作为细菌生长的氮源。
讨论：
1.如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？
●设计一种选择培养基，用尿素作为唯一氮源，可以将分解尿素的细菌分离出来。
CO(NH2)2 + H2O CO2 +2NH3
脲酶
选择培养基配方的设计
尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可以作为细菌生长的氮源。
讨论：
2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
●这种培养基与普通培养基相比，只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分基本相同。
CO(NH2)2 + H2O CO2 +2NH3
脲酶
（二）微生物的选择培养
1、微生物选择培养的其他条件
2、 稀释涂布平板法
1、微生物选择培养的其他条件
如果想要知道1g土壤中有多少能分解尿素的细菌，仅有选择培养基是不够的，还需要对土样进行适当的处理以及科学的测定微生物数量的方法。
2、 稀释涂布平板法
由于土壤中细菌数量庞大，想要得到能分解尿素的细菌的纯培养物，必须要对土样进行充分稀释（稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落），然后再将菌液涂布到制备好的选择培养基上，也就是要采用稀释涂布平板法，其操作如图。
（1）取样与样品梯度稀释
（2）涂布平板
（3）培养与观察
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板和一未涂布的平板倒置，放在30-37℃恒温箱中培养1-2d。在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到单菌落。
（三）微生物的数量测定
1、稀释涂布平板法的应用
2、稀释涂布平板法的计数原理
3、稀释度确定的原则
4、重复与对照
5、计数的误差
6、显微镜直接计数法
1、稀释涂布平板法的应用
稀释涂布平板法除可以用于分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目，即分离和计数。
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
为了保证结果准确，一般选择菌落数为30～300的平板进行计数。
计算公式
每g样品中的菌落数＝(C÷V)×M
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数； V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)； M代表稀释倍数。
2、稀释涂布平板法的计数原理
3、稀释度确定的原则
样品的稀释度将直接影响平板上的菌落数目。
在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养（即设置一系列浓度梯度的稀释液），以保证获得菌落数为30～300 、适于计数的平板。
4、重复与对照
在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。
重复
对照
对照有两类，一类是空白的选择培养基和空白的牛肉膏蛋白胨培养基与涂布的平板的对照，一类是涂布的选择培养基和涂布的牛肉膏蛋白胨培养基的对照。
5、计数的误差
统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。
6、显微镜直接计数法
利用显微镜直接计数，也是一种常用的、快速直观的测定微生物数量的方法。
该方法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量，统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和。
血细胞计数板常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。细菌计数板可对细菌等较小细胞进行计数。
（四）土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
1、实验原理
2、选择培养基的成分
3、实验设计
4、操作提示
5、结果分析与评价
6、进一步探究
1、实验原理
2、选择培养基的成分
组分 含量
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
琼脂 15.0g
H2O 定容至1000mL
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
3、实验设计
细菌适宜再酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大多数分布在距地表 3~8 cm 的土壤层。因此，取样时一般要铲去表层土，取距地表 3~8 cm 的土壤层,将样品装入纸袋中。
（1）土壤取样
一般选用 1×104、1×105、1×106 倍的稀释液进行平板培养。
在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，应选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数。
（2）样品稀释
培养基配制的过程和酵母菌纯培养过程中配制的过程一样，不同的是，本实验要配制两种培养基，一种是以尿素为唯一氮源的选择培养基，一种是牛肉膏蛋白胨培养基，牛肉膏蛋白胨培养基作为对照检测选择培养基是否起到选择作用。
涂布平板时每种稀释浓度各涂布三个选择培养基，一个牛肉膏蛋白胨培养基。
（3）培养基配制与涂布平板
（3）培养基配制与涂布平板
每个浓度至少设置4个平板，1、2、3平板是选择培养基（实验组，三个重复），4为牛肉膏蛋白胨培养基（用以判断选择培养基是否具有选择作用）
将涂布好的平板和一个未涂布的选择培养基平板以及一个未涂布的牛肉膏蛋白胨培养基共同培养。
不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d。本实验中，我们可以每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。
（4）微生物的培养与观察
4、操作提示
（1）不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。
（2）要按照前面学习过的无菌操作的方法进行规范操作。取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。
（3）本实验使用的平板和试管比较多，为避免混淆，最好在使用前要做好标记。标记要写在培养皿底部外侧。
（4）本实验耗时较长，要事先规划时间，以便提高工作效率，在操作时更加有条不紊
5、结果分析与评价
如果没有接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。如果接种后的完全培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基筛选出了一些尿素分解菌。
(1)结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。
如果得到了两个或多个菌落数为30～300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。
(2) 你是否获得了某一稀释度下菌落数为30~300的平板？在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近？
如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。
(3) 你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数是多少？与其他同学统计的结果接近吗？如果差异很大,可能是什么原因引起的？
6、进一步探究
细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发生了该化学反应，进而判断该菌是否为尿素分解细菌。
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红：
（1）液体培养基可以直接看液体的变色情况；
（2）固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。
到社会中去
1、空气中微生物总数的检测？
2、水中细菌总数的检测？
3、牛奶中细菌的分离与计数？
4、土壤中真菌（或放线菌）的分离与计数？
活菌计数技术广泛应用于食品卫生、水源污染度的检验和土壤含菌量的测定等方面。如果你感兴趣，可以从下列项目中选做一个，并走访相关部门或企业，了解它们是如何进行检测的。
帮范儿
再会

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