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第二节 动物细胞工程（二）
二、动物细胞融合技术与单克隆抗体
（一）动物细胞融合技术
1、概念
2、原理
3、方法
4、流程5、比较
6、意义
7、应用
1、概念
动物细胞融合技术就是使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。
融合后形成的杂交细胞具有原来两个或多个细胞的遗传信息。
2、原理
与植物原生质体融合的基本原理相同，即细胞膜的流动性。
3、方法
PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法等。
灭活是指用物理或化学手段使病毒失去感染能力，但是并不破坏病毒的抗原结构。
灭活病毒诱导法的原理：病毒表面的糖蛋白和一些酶与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
相关信息
4、流程
动物细胞融合过程
植物体细胞杂交过程
去壁
融合
组织培养
再生
5、比较
6、意义
突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交（种间、属间、科间、动植物之间）成为可能。
7、应用
（1）细胞融合技术已经成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。
（2）利用动物细胞融合技术发展起来的杂交瘤技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。
（二）单克隆抗体及其应用
1、早期获得抗体的方法及局限
2、B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的特点
3、单克隆抗体制作的流程
4、思考讨论
5、单克隆抗体的优点和应用
1、早期获得抗体的方法及局限
方法
向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，从动物血清中分离所需抗体。
缺点
产量低、纯度低、特异性差。
2、B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的特点
B淋巴细胞的特点
能产生特异性抗体，但不能无限增殖。
骨髓瘤细胞的特点
能大量增殖，但不能产生特异性抗体。
旁栏思考
19世纪30年代，科学家曾在患肺结核、天花和麻疹等疾病的病人病理组织中观察到多核细胞。如何解释这一现象？
病人体内的病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。
米尔斯坦
科勒
通过实验，他们得到了单克隆抗体。由于发明了单克隆抗体的制备技术，米尔斯坦和科勒于1984年获得了诺贝尔生理学或医学奖。
1975年英国科学家米尔斯坦和德国科学家科勒大胆设想：
B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
融合细胞
3、单克隆抗体制作的流程
注射特定的抗原
多种B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合
诱导融合
培养骨髓瘤细胞
用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞。
3、单克隆抗体制作的流程
多种杂交细胞（B-骨）
（B-B）
（骨-骨）
用特定的选择培养基进行筛选:在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。
第一次筛选：
用特定的选择培养基
杂交瘤细胞(既能迅速大量增殖，又能产生抗体)
3、单克隆抗体制作的流程
第二次筛选：
克隆化培养、抗体检测
（可进行多次）
对上述经选择培养的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选，就可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞(分泌的抗体能与特定抗原结合)
用96孔板培养和筛选杂交瘤细胞，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞
3、单克隆抗体制作的流程
注射到小鼠腹腔内
体外培养
将抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞在体外条件下大规模培养，或注射到小鼠腹腔内增殖。
从细胞培养液或小鼠腹水中获取大量的单克隆抗体。
单克隆抗体
单克隆抗体的应用
资料1 用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的“早早孕诊断试剂盒”。在妊娠第8天就可以作出诊断，这比原来的诊断方法提前了10d左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。
资料2 使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素没有特异性，
在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用。抗体-药物偶联物（antibody-drugconjugates, ADC）通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由抗体、接头和药物(如细胞毒素)三部分组成，它的作用机制如下图所示。
单克隆抗体的应用
抗体
药物
接头
ADC被细胞吞噬
释放药物
溶酶体裂解
细胞凋亡
1. ADC的抗体和药物各具有什么作用？
讨论
抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞；
药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞
讨论
2. 除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？
① 可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗；
② 一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗
讨论
3. 单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？
① 单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高；生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用，有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒；
② ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。
5、单克隆抗体的优点和应用
优点
单克隆抗体能准确地识别抗原的细微差异， 与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备。
应用
(1)作为诊断试剂，如定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。
(2)运载药物，如ADC。
(3)治疗疾病。
1.动物细胞融合技术最重要的用途是（ ）
A.克服远缘杂交不亲和
B.制备单克隆抗体
C.培育新品种
D.生产杂种细胞
B
2.单克隆抗体制备过程中，涉及的生物学原理是（ ）
①动物细胞核具有全能性
②细胞膜具有一定的流动性
③肿瘤细胞能无限增殖
④一个浆细胞产生一种抗体
A.①③ B.②③④ C.④ D.①②④
B
3.植物体细胞杂交和动物细胞融合比较，正确的是（ ）
A.诱导融合的方法完全相同
B.所用的技术手段基本相同
C.所采用的原理完全相同
D.都能形成杂种细胞
D
4.单克隆抗体制备过程中，对骨髓瘤细胞和B淋巴细胞诱导融合后，要用特定的选择培养基筛选出杂交瘤细胞。在这种培养基上不能存活、增殖的细胞是 ( )
①B淋巴细胞②骨髓瘤细胞③B淋巴细胞自身融合细胞④骨髓瘤细胞自身融合细胞 ⑤杂交瘤细胞
A.①②③④ B.①③⑤ C.②④ D.①③
A
5.下列有关单克隆抗体制备及其应用的叙述，不正确的是 ( )
A.制备单克隆抗体运用的技术有动物细胞培养和动物细胞融合
B.需要用选择培养基筛选杂交瘤细胞
C.需要从杂交瘤细胞中筛选出能产生特定抗体的细胞
D.利用“ADC”治疗癌症就是利用了单克隆抗体清除癌细胞的特性
D
B
6.如图为细胞融合的示意图，下列叙述正确的是(　　)
A．若a细胞和b细胞是植物细胞，需先去分化再诱导融合
B．a细胞和b细胞之间的融合需要促融处理后才能实现
C．c细胞的形成与a、b细胞膜的流动性无关
D．c细胞将同时表达a细胞和b细胞中的所有基因
7．下列对植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较，描述正确的是(　　)
A．动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理相同，诱导融合的方法也完全相同
B．只有植物体细胞杂交可跨越种属间的生殖隔离，突破有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能
C．利用动物细胞融合技术而发展起来的杂交瘤技术，为生产单克隆抗体开辟了新途径
D．目前科学家终于实现了两个植物物种间的体细胞杂交，得到了同时具有两个物种遗传物质的超级植物，并使它们的性状全部得以体现
C
8．下列关于单克隆抗体制备过程的叙述，错误的是(　　)
A．获得B细胞之前需给动物注射特定的抗原
B．分离出的B细胞应与骨髓瘤细胞融合
C．需要从融合的细胞中筛选出杂交瘤细胞
D．得到的所有杂交瘤细胞产生的抗体均相同
D
B
9．下图表示用仙台病毒诱导动物细胞融合的部分过程，下列相关叙述正确的是(　　)
A．细胞A和细胞B必须为同种细胞才能融合
B．细胞C同时有细胞A和细胞B的遗传物质
C．该融合过程体现了细胞膜具有选择透过性
D．植物细胞的融合过程与动物细胞完全相同
B
10．细胞毒素可有效杀伤肿瘤细胞，但没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害。下图所示为特异性杀死肿瘤细胞的过程，图中抗体是利用单克隆抗体技术制备的。下列叙述不正确的是(　　)
A．抗体制备需用细胞融合技术
B．细胞毒素具有与肿瘤细胞膜上的糖蛋白发生特异性结合的能力
C．溶酶体破裂加速肿瘤细胞凋亡
D．抗体可使细胞毒素进行特异性地杀伤
帮范儿
再会

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