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第二节 动物细胞工程（一）
在治疗大面积烧伤时，通常采用的方法是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植。但对这样的病人来说，自体健康皮肤非常有限，使用他人皮肤来源又不足，而且会产生免疫排斥反应。那么，怎样才能获得大量的自体健康皮肤？能不能用自体皮肤的单个细胞培养出可供移植的皮肤？
可以从病人身上取少量正常、健康的皮肤在体外进行培养、扩增；
目前，科学家还在研究对皮肤干细胞进行培养，以获得适合临床上使用的人造皮肤；
通过细胞培养构建的人造皮肤
动物细胞工程常用技术包括动物细胞培养、动物细胞融合和动物细胞核移植等，其中动物细胞培养是动物细胞工程的基础。
一、动物细胞培养技术
动物细胞培养
动物细胞培养是指从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。
动物细胞培养的原理
细胞增殖。
（一）动物细胞培养的条件
1、体内细胞正常生长增殖的原因
2、动物细胞培养的条件
1、体内细胞正常生长增殖的原因
动物体内的细胞之所以能够维持正常的生命活动，有些细胞还能不断增值，是因为机体给这些细胞提供了适宜的条件，包括充足的营养、稳定的内环境等。
2、动物细胞培养的条件
（1）营养
细胞在体外培养时，培养基中应含有细胞所需的各种营养物质。
将细胞所需的将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制而成的培养基，称为合成培养基。合成培养基一般包括糖类、氨基酸、无机盐、维生素、促生长因子、微量元素等。
由于人们对细胞所需的营养物质尚未全部研究清楚，因此，在使用合成培养基时，通常需要加入血清等一些天然成分。
培养动物细胞一般使用液体培养基，也称为培养液。
在体外培养细胞时，必须保证环境是无菌、无毒的。
需要对培养液和所有培养用具进行灭菌处理以及在无菌环境下进行操作。
培养液还需要定期更换，以便清楚代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。
（２）无菌、无毒的环境
温度：哺乳动物多以36.5±0.5 ℃为宜。
pH：多数细胞适宜pH为7.2～7.4。
渗透压也是动物细胞培养过程中需要考虑的一个重要参数，一般与细胞内液渗透压相等。
（3）温度、pH和渗透压
动物细胞培养所需气体主要有O2和CO2。
O2是细胞代谢所必需的； CO2维持培养液的pH。
在进行细胞培养时，通常采用培养皿或松盖培养瓶， 并将它们置于含有95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中进行培养。
（4）气体环境
培养皿
培养瓶
CO2培养箱
（二）动物细胞的培养过程
1、培养过程
2、思考讨论
1、培养过程
取动物组织
制成细胞悬液
转入培养液进行原代培养
放入CO2培养箱中培养
传代培养
放入CO2培养箱中培养
用机械的方法，或用胰蛋白酶，胶原蛋白酶等处理的方法，将组织分散成单个细胞
悬浮生长
贴壁生长
问题
细胞分裂受阻
原因
细胞密度过大、有害代谢物积累和营养物质缺乏等，贴壁生长的细胞还发生接触抑制现象。
解决
相关概念
细胞贴壁：体外培养的动物细胞一类需要贴附于某些基质表面才能生长增殖，大多数细胞属于这种类型，这类细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上，这种现象称为细胞贴壁。
接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面接触时，细胞通常会停止分裂增殖，称为接触抑制。
原代培养与传代培养：人们通常将分瓶之前的细胞培养，即动物组织经处理后的初次培养称为原代培养，将分瓶后的细胞培养称为传代培养。
单层贴壁的猪输卵管上皮细胞
在进行传代培养时，悬浮培养的细胞直接用离心法收集。
贴壁细胞需要重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后用离心法收集。之后，将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养。
旁栏思考
进行动物细胞培养时常用胰蛋白酶分散细胞，这说明细胞间的物质主要是什么成分？用胃蛋白酶行吗？
用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是蛋白质。
胃蛋白酶作用的适宜pH约为2,当pH大于6时，胃蛋白酶就会失去活性。多数动物细胞培养的适宜pH为7.2～7.4，胃蛋白酶在此环境中没有活性，所以用胃蛋白酶不行。
有关动物细胞培养的问题
1.幼龄动物的细胞与老龄动物的细胞比较，分化程度低的细胞与分化程度高的细胞比较，哪些细胞更易于培养？为什么？
细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物的细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物的细胞则相反。所以，一般来说，幼龄动物的细胞比老龄动物的细胞易于培养。同样，分化程度越低的细胞，增殖能力越强，所以更容易培养。
2.动物细胞培养和植物组织培养有什么相同和不同之处？
比较项目 植物组织培养 动物细胞培养
原理
培养基性质
培养基特有成分
培养结果
培养目的
相同点
获得细胞或细胞产物
常用固体培养基
植物体
葡萄糖、动物血清
常用液体培养基
细胞增殖
细胞的全能性
许多细胞
快速繁殖等
蔗糖、植物激素
1.培养过程中细胞都进行有丝分裂，不涉及减数分裂；
2.均需无菌操作，需要适宜的温度、pH等条件
（三）干细胞培养及其应用
1、干细胞
2、胚胎干细胞
3、成体干细胞
4、干细胞的应用
5、iPS细胞
6、干细胞的应用前景
1、干细胞
在一定条件下，干细胞可以分化成其他类型的细胞。
干细胞存在于早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中。
包括胚胎干细胞和成体干细胞。
2、胚胎干细胞
胚胎干细胞是存在于早期胚胎中，具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。
概念
成体干细胞是成体组织或器官内的干细胞，包括骨髓中的造血干细胞、神经系统中的神经千细胞、睾丸中的精原千细胞。
特点
具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力。
3、成体干细胞
造血干细胞
造血干细胞是发现最早、研究最多的、应用最成熟的实例，主要存在于成体的骨髓、外周血和脐带血中。
3、成体干细胞
4、干细胞的应用
有着自我更新能力及分化潜能的干细胞，与组织、器官的发育、再生和修复等密切相关，因而在医学上有着广泛的应用。
造血干细胞移植，是恢复病人的造血功能和免疫功能，治疗白血病、一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病的一种重要手段。
神经干细胞在治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病(如帕金森病、阿尔茨海默病等)有重要价值。
5、iPS细胞
胚胎干细胞的局限性
胚胎干细胞必须从胚胎中获取，这涉及伦理问题；因而限制了在医学上的应用。
诱导多能干（iPS）细胞的概念
通过体外诱导小鼠成纤维细胞，获得了类似胚胎干细胞的一种细胞，称为诱导多能干细胞，简称iPS细胞。
5、iPS细胞
iPS细胞的应用
治疗小鼠的镰状细胞贫血；现在用iPS细胞治疗阿尔茨海默病、心血管疾病等领域的研究也取得了新进展。
iPS细胞用于治疗人类疾病示意图
5、iPS细胞
iPS细胞的制备
诱导方法：①借助载体将特定基因导入细胞中；②直接将特定蛋白导入细胞中；③用小分子化合物来诱导。
iPS细胞的优点
①诱导过程无需破坏胚胎； ② iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应。
6、干细胞的应用前景
干细胞的研究正在如火如荼地开展。虽然将干细胞用于临床治疗还面临一些问题，如存在导致肿瘤发生的风险，但是我们相信，随着理论和技术的不断完善，干细胞将在再生医学、药物安全性与有效性检测等领域发挥大作用。
帮范儿
再会

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