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(共32张PPT)
第二节 基因工程的基本操作程序
1、植物目的基因的导入方法
2、动物目的基因的导入方法
3、微生物目的基因的导入方法
三、将目的基因导入受体细胞
（1）花粉管通道法
（2）农杆菌转化法
①转化
②农杆菌的特点
③转化过程
④受体细胞
1、植物目的基因的导入方法
（1）花粉管通道法
我国科学家独创的方法，其受体细胞为受精卵。方法如下：
方法一：用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；
方法二：在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
子房
花粉
柱头
花粉管
精子
卵细胞
胚囊
（2）农杆菌转化法
①转化
转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。
（2）农杆菌转化法
②农杆菌的特点
a.能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。
b.农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
③转化过程
T-DNA
目的基因
构建基因表达载体
含目的基因的重组Ti质粒
转入农杆菌
含重组Ti质粒的农杆菌
导入植物细胞
表现出新性状的植物
植物细胞
将目的基因插入染色体DNA中
④受体细胞
a、体细胞。可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，通过植物组织培养再生成植株。
b、受精卵。可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。
随着转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。
2、动物目的基因的导入方法
受体细胞为受精卵。
导入方法通常为显微注射法。
获得的重组细胞一般需要通过早期胚胎培养和胚胎移植获得个体。
3、微生物目的基因的导入方法
Ca2+处理大肠杆菌
使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞
将重组的基因表达载体导入其中
感受态细胞
吸收
1、目的与意义
2、检测与鉴定
3、小结
四、目的基因的检测与鉴定
1、目的与意义
目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道，这也是检查转基因是否成功的一步。
2、检测与鉴定
类型 检测内容 方法
分子水平的检测
个体生物学水平的鉴定
受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因
目的基因是否转录出了mRNA
PCR等技术
目的基因是否翻译成蛋白质
抗原-抗体杂交技术
个体是否具有相应性状
病原体接种实验等
3、小结
获取质粒、噬菌体等载体
筛选和获取目的基因
用限制酶切割载体和含有目的基因的DNA片段，然后用DNA连接酶连接，构建基因表达载体
将含有目的基因的表达载体导入受体细胞
检测和鉴定目的基因是否稳定维持和表达其遗传特性
目前，基因工程已经步入产业化发展阶段，具有巨大的生产力和发展潜力，我们在充满信心和期待的同时，还要严格规范操作流程，科学、客观地评估风险，只有这样，才能让基因工程永葆生机。
基因工程的基本操作流程图
到社会中去
1.在实际种植过程中，棉铃虫是否对转Bt基因的抗虫棉产生了严重的抗性？证据是什么？
科研人员对长江流域种植的转基因抗虫棉进行了监测，2011年的数据显示，大部分转基因抗虫棉品种的抗虫性属于中抗及高抗水平；2013年的数据表明，如果棉田周围存在大量天然庇护所，靶标害虫棉铃虫、红铃虫等并未对转Bt基因的抗虫棉产生明显抗性。在我国、澳大利亚、印度等国的多个实验室中，通过毒素的连续抗性筛选，已经培育出多个高抗水平的转基因抗虫棉品种。
到社会中去
2.科研工作者在没有发现棉铃虫出现抗性之前，就应该想办法应对。他们想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有哪些？这些措施的原理是什么？有效吗？
科研人员想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有很多，主要可以分为以下几个方面。
（1）基因策略。该策略是在分子水平上提高转基因抗虫棉的抗虫性和抗虫持久性。包括在棉花中转入多个杀虫基因、构建组织特异性表达的启动子、提高杀虫基因的表达量等。例如，最早种植的抗虫棉中只转入了一种Bt基因，抗性比较单一；现在经常将两种或两种以上的Bt基因(如CrylAa和CrylAc基因)同时转入棉花细胞，这样既可以提高杀虫活性，又可以延缓害虫抗性的产生和发展，还可以通过不同基因间的互补作用扩大抗虫范围。
到社会中去
2.科研工作者在没有发现棉铃虫出现抗性之前，就应该想办法应对。他们想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有哪些？这些措施的原理是什么？有效吗？
（2）田间策略。这是在种植时采取的措施，如提供庇护所、与其他作物轮作或套种等。例如，在澳大利亚和美国等地普遍采取的措施是在转基因棉田中，总面积的4%种植不使用任何杀虫剂的非转基因棉花，或在转基因棉田周围种植20%～30%面积的可使用化学杀虫剂的非转基因棉花；在印度，一些地区要求，在转基因棉田周围至少种植5行或者20%面积的非转基因棉花。我国除新疆棉区及大型农场需设计专门的庇护所外，其他棉区如长江、黄河流域棉区多采用多种作物混作的耕作制度(如将转基因抗虫棉与番茄、向日葵、高梁、玉米、辣椒等棉铃虫寄主作物混作)，这些作物可以构成天然的庇护所，一般无须种植非转基因棉花作为庇护所。这样做的原理是为少部分害虫提供一个正常的取食环境，始终保持一定的敏感目标害虫种群。这样，即使目标害虫对转基因抗虫棉产生了抗性，但是因为其与敏感目标害虫交配，后代抗性基因会发生分离，所以抗性目标害虫的种群也不至于迅速增加。
到社会中去
2.科研工作者在没有发现棉铃虫出现抗性之前，就应该想办法应对。他们想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有哪些？这些措施的原理是什么？有效吗？
（3）国家宏观调控策略。该策略包括实施分区种植管理、加强抗性监测、 进行严格的安全生评价等。
1、原理
2、材料试剂
3、方法步骤
4、注意
5、结果分析与评价
探究﹒实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定
1、原理
利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增。PCR利用了DNA热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
1、原理
DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。PCR 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构像等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
DNA片段的扩增及电泳鉴定
2、材料试剂
①PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增）
②微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所）
③微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）
④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）
⑤电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）
DNA片段的扩增及电泳鉴定
2、材料试剂
⑥4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。
⑦电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等
⑧PCR反应体系的配方
DNA片段的扩增及电泳鉴定
PCR反应体系的配方
10倍浓缩的扩增缓冲液 5ul
20mmol/l 的4种脱氧核苷酸的等量混合液 1ul
20umol/l 的引物I 2.5ul
20umol/l 的引物II 2.5ul
H2O 28-33ul
1-5U/ul 的Taq DNA聚合酶 1-2U
模板DNA 5-10ul
总体积 50ul
注：模板DNA的用量为1pg-1ug
DNA片段的扩增及电泳鉴定
3、方法步骤
（1）配反应液。用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量移液管中依次加入各组分。
（2）离心。待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
3、方法步骤
（3）设置PCR反应程序。参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 940C，5min —— ——
30 次 940C, 30s 550C, 30s 720C，1min
最后一次 940C，1min 550C, 30s 720C，1min
DNA片段的扩增及电泳鉴定
3、方法步骤
制备琼脂糖胶。
（4）根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
（5）将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
（6）待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
3、方法步骤
（7）倒电泳液。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。
（8）点样。将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。
（9）电泳。接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1-5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时， 停止电泳。
（10）观察记录。取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
4、注意
（1）为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
（2）该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
（3）在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
（4）在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
5、结果分析与评价
（1）你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
5、结果分析与评价
（2）你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。
如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
帮范儿
再会

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