资源简介

(共21张PPT)
3.2 基因工程的基本操作程序
1.基因工程的基本操作程序
2.基因工程每一步涉及的技术和方法
获得目的基因后直接转入受体吗？
不是，游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因。
2.基因表达载体的构建
构建基因表达载体的目的
使目的基因在受体细胞中稳定存在
使目的基因可以遗传给下一代
使目的基因能够表达和发挥作用
基因表达载体的构建是基因工程的核心工作。
一段特殊DNA序列，位于基因的上游，是RNA聚合酶的识别和结合位点，启动转录过程。
一段特殊DNA序列，位于基因的上游，终止转录。
筛选含目的基因(重组DNA分子)的受体细胞
2.基因表达载体的构建
2.基因表达载体的构建
“启动子与终止子”和“起始密码子与终止密码子”
启动子与终止子位于DNA分子中，起始和终止转录过程。
启动密码子与终止密码子位于mRNA分子中，起始和终止翻译过程。
(1)基因工程中的基因表达载体≠载体：基因表达载体与载体相比增加了 。
目的基因
(2)目的基因插入位点不是随意的：基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入 ，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。
启动子和终止子之间的部位
注意:
基因表达载体构建的流程：
①用限制酶切割载体，使它出现一个缺口；
②用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段，获取目的基因；
③用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体缺口处，形成重组DNA分子（基因表达载体、重组质粒）。
重组DNA分子
目的基因
2.基因表达载体的构建
目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。
1.下列哪项不是基因表达载体的组成部分(　　)A．启动子 B．终止密码子C．标记基因 D．目的基因
B
2、下列关于基因表达载体的叙述不正确的是(　　)
A．启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起始密码
B．启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对mRNA的转录起调控作用
C．标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选
D．基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别
A
2.基因表达载体的构建
常用的受体细胞：
有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。
转化：
目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程
受体细胞
稳定
表达
方法：
植物细胞：
动物细胞：
微生物细胞：
花粉管通道法、农杆菌转化法、基因枪法
显微注射技术
Ca2+处理法(感受态细胞法)
由于受体细胞有植物、动物、微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，因此，基因表达载体的构建也会有差别；
3.将目的基因导入受体细胞
花粉
外源DNA
花粉管
子房
胚珠
1.花粉管通道法：
②在植物授粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。
①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；
植物细胞：
3.将目的基因导入受体细胞
植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。
我国科学家独创的一种方法
吸引农杆菌向受伤组织集中
双子叶、裸子植物
伤口分泌酚类物质和糖类物质
受损
将Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞中，并且将其整合到该细胞染色体DNA上。
农杆菌转化法
激活Vir区基因，导致T-DNA加工和转移
植物细胞：
3.将目的基因导入受体细胞
特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力
表达载体提纯
受精卵
胚胎
雌性动物的输卵管或子宫内
显微注射
早期胚胎培养
胚胎移植
新性状的动物
发育
显微注射法
动物细胞：
3.将目的基因导入受体细胞
受精卵全能性高，高度分化的体细胞全能性受到抑制
Ca2+
用CaCl2处理大肠杆菌，增加细菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入宿主细胞。
感受态细胞
吸收
大肠杆菌
感受态细胞
Ca2+
混合
表达载体
缓冲液
溶于
吸收DNA，完成转化
Ca2+处理法
微生物细胞：
3.将目的基因导入受体细胞
使大肠杆菌处于一种易于吸收周围环境中DNA分子的生理状态
外源基因在受体细胞中能表达的原因(基因工程得以实现的理论基础)：
②基因是控制生物性状的基本遗传单位，其表达具有一定的独立性，不同生物的基因在表达时都遵循“中心法则”，在受体细胞内定向表达；(前提条件)
①不同生物的DNA分子的结构基本相同，都以4种脱氧核苷酸为基本组成单位，具有独特的双螺旋结构(物质基础)；
③所有生物共同一套遗传密码。(表达提供可能)
Ca2+
Ca2+处理法
微生物细胞：
3.将目的基因导入受体细胞
受体细胞 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用方法 农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法 显微注射技术 感受态细胞法
受体细胞 体细胞 受精卵 原核细胞
转化过程 以农杆菌转化法为例： 将目的基因插入Ti质粒的T DNA上 ↓ 转入农杆菌中 ↓ 导入植物细胞 ↓ 整合到受体细胞的DNA上 提纯含目的基 因的表达载体 ↓ 显微注射 ↓ 受精卵发育 ↓ 具有新性 状的个体 Ca2＋处理细胞
↓
感受态细胞
↓
基因表达载体与
感受态细胞混合
↓
感受态细胞
吸收DNA分子
3.将目的基因导入受体细胞
1、基因工程常用的受体细胞有
①大肠杆菌 ②枯草杆菌 ③支原体 ④动植物细胞
A．①②③④ B．①②③ C．②③④ D．①②④
D
2、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是
A.人工合成基因 B.目的基因与运载体结合
C.将目的基因导入受体细胞
D.目的基因的检测和表达
C
3.将目的基因导入受体细胞
3.体细胞不同，将目的基因导入受体细胞的方法也不相同，下列受体细胞与导入方法匹配错误的是(　　)
选项 受体细胞 导入方法
A 棉花细胞 花粉管通道法
B 大肠杆菌 农杆菌转化法
C 羊受精卵 显微注射技术
D 小麦细胞 基因枪法
B
3.将目的基因导入受体细胞
在棉花细胞中，重组表达载体是否导入成功？是否可以稳定维持并表达出Bt蛋白？表达出的Bt蛋白是否具有杀虫的功效？
4.目的基因的检测与鉴定
检测目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。
1.目的：
2.检测内容及方法：
类型 检测内容 方法
分子水平的检测
个体生物学水平的鉴定
受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因
目的基因是否转录出了mRNA
PCR等技术
目的基因是否翻译成蛋白质
抗原-抗体杂交技术
个体是否具有相应性状
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
DNA分子杂交（Southern-blot)流程图
4.目的基因的检测与鉴定
分子水平的检测——基因是否插入染色体DNA（存在）
非转基因棉花
转基因抗虫棉
阴性对照
Marker
方法：PCR扩增或DNA分子杂交技术
DNA分子杂交结果图
4.目的基因的检测与鉴定
分子水平的检测—— 基因是否转录
方法：RT-PCR或DNA分子杂交技术
RNA分子杂交(Northern Blot)流程图
Bt基因在抗虫棉中的表达
从左至右依次是苗期叶片、花铃期叶片，苞叶，花，雌雄蕊和铃壳
Bt抗虫蛋白
4.目的基因的检测与鉴定
分子水平的检测—— 基因是否翻译为蛋白质
方法：抗原-抗体杂交技术
苏云金芽孢杆菌
提取
Bt毒蛋白
注射小鼠体内
抗体
标记抗体
提取蛋白
电泳分离
抗原
抗体
杂交
4.目的基因的检测与鉴定
个体生物学水平的鉴定—— 个体是否具有相应性状
方法：抗虫鉴定、抗病鉴定、
抗虫或抗病接种实验
与天然产品的功能进行活性比较
接种棉铃虫观察性状表现，或采摘抗虫棉的叶子饲喂棉铃虫，观察抗虫效果。
3．下列关于将目的基因导入受体细胞的叙述，错误的是(　　)
A．可利用花粉管通道法培育转基因植物
B．用Ca2＋处理大肠杆菌，以改变大肠杆菌细胞的生理状态
C．对于动物来说，受体细胞一般是受精卵
D．将目的基因转入微生物细胞常用显微注射法
D
4.目的基因的检测与鉴定

展开更多......

收起↑