资源简介

(共29张PPT)
1.2.2 微生物的选择培养和计数
1.理解选择培养的原理
2.如何通过调整培养基的配方来有目的地培养某种微生物
3.进行土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
1.2 微生物的培养技术及应用
自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合的菌群中不是优势种群时，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。该怎么办呢？
1.选择培养基
如何从自然界中分离出需要的特定微生物？
1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌( Thermus aquaticus)，进而从这种菌中提取出耐高温的DNA聚合酶。这种酶目前已被广泛用于体外扩增DNA片段的聚合酶链式反应(PCR)。
这是因为水生栖热菌能在 70~80 ℃的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
1.为什么水生栖热菌能从热泉中被筛选出来呢？
2.以上例子给我们在分离纯化微生物带来什么启示？
实验室中微生物的筛选，也可以应用同样的原理，即人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度和pH等) ，同时抑制或阻止其他微生物的生长。
1.选择培养基
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。
1.定义：
2.类型：
1.选择培养基
①加富性选择培养基
在培养基中加入分离对象“嗜好”的营养物质。
(投其所好)
②抑制性选择培养基
在培养基中加入分离对象对能够抵抗的某种抗菌物质。
(取其所抗)
3.实例：
①水生栖热菌的应用
水生栖热菌
耐高温DNA聚合酶
提取
用于
PCR
②筛选原理
水生栖热菌能在70~80℃高温条件下生存，绝大多数微生物在此条件下不能生存。
尿素[CO(NH2)2]含氮量高，化学性质相对稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，NH3再转化为NO3-，NH4+等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可以为细菌生长的氮源。
选择培养基配方的设计
CO(NH2)2 + H2O
CO2 + 2NH3
脲酶
转化
NH4+
NO3-
1.选择培养基
讨论1:如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？
设计一种选择培养基，用尿素作为唯一氮源，可以将分解尿素的细菌分离出来。
讨论2：该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
这种培养基与普通培养基相比，只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分基本相同。
1.选择培养基
由以上分析，可以知道如何分离土壤中能分解尿素的细菌，然而，能否估算出 1 g 土壤中的有多少分解尿素的细菌呢？要如何解决？
不能，还需要对土壤进行适当的处理以及科学的测定微生物数量的方法。由于土壤中细菌的数量庞大，要想得到能分解尿素的细菌的纯培养物，必须对土壤进行充分稀释，然后再将菌液涂布在制备好的选择培养基上，也就是要采用稀释涂布平板法。
2.微生物的选择培养
1.方法:
稀释涂布平板法
2.原理:
由于土壤细菌的数量庞大，要想得到特定微生物的纯培养物，必须要对土壤进行充分稀释，然后再将菌液涂布到制备好的选择培养基上——两个基本操作：梯度稀释和涂布平板。
2.微生物的选择培养
选择培养基
稀释涂布平板
单菌落
+
→
3.操作过程:
第1步：取样并稀释10倍
1×10
90mL无菌水
10g
2
铲取土样，将样品装入纸袋中。
将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶，充分摇匀，制成菌液。
1
第2步：梯度稀释
1×10
90mL无菌水
3
取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
107
1×
1×
1×
1×
1×
1×
106
105
104
103
102
1mL
1mL
1mL
1mL
1mL
1mL
9mL无菌水
2.微生物的选择培养
3.操作过程:
4
取0.1mL菌液，
滴加到培养基表面
用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
7
将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
6
将涂布浸在盛有酒精的烧杯中。
5
2.微生物的选择培养
第3步：涂布平板
3.操作过程:
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37℃的恒温培养箱中培养1～2d，在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落。
4.培养与观察
稀释涂布平板操作后分离得到单菌落
2.微生物的选择培养
稀释103倍
稀释104倍
稀释105倍
空白对照
恒温培养箱
获得单菌落的方法：
平板划线法
稀释涂布平板法
稀释涂布平板法除了可以用于分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目。
2.微生物的选择培养
根据平板划线法和稀释涂布平板法培养细菌的结果，思考：如果要对菌落进行计数，则哪种方法可行？为什么？得到的细菌数量是确切的细菌数量吗？
原因：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
1.间接计数法——稀释涂布平板法
（1）原理：
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
3.微生物的数量测定
（2）计数原则：
① 一般选择菌落数为30～300的平板计数。
② 在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。
③ 适当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。
（3）结果分析：
①统计的菌落数往往比活菌的实际数目少；
②统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。
234÷0.1×106
（4）计算公式：
每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)；
M代表稀释倍数。
例1.某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL) ( )
A.2.34×108 B.2.34×109 C.234 D.23.4
B
（5）使用范围：
可以用来测定土壤、水、食品等样品中的细菌、酵母菌、芽孢和孢子等的数量，但不适于测定样品中的放线菌、丝状真菌等丝状体微生物的数量。
1.间接计数法——稀释涂布平板法
3.微生物的数量测定
为了避免上述缺点，可以染色后进行显微镜计数。
1.原理：
利用特定的______________或_______________在________下观察、计数，然后再计算__________的样品中微生物的数量；
2.优点： ________
3.缺点：
（1）统计结果一般是________________________不能区分死菌与活菌
（2）个体小的细菌在显微镜下难以观察
细菌计数板
血细胞计数板
显微镜
一定体积
快速直观
活菌数和死菌数的总和
2.直接计数法——显微镜直接计数
3.微生物的数量测定
*血细胞计数板常用对相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等；
*细菌计数板可对细菌等较小的细胞进行观察和计数；
设备简单，能观察微生物的形态特征。
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成_____的微生物才能分解尿素，利用______________________的______培养基，可以从土壤中分离出___________的细菌.
脲酶
以尿素作为唯一氮源
选择
分解尿素
组分 含量
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
琼脂 15.0g
H2O
定容至1000mL
4.土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
（1）实验目的：
（2）实验原理：
1.从土壤中分离出能够分解尿素的细菌
2.统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌
常见的分解尿素的微生物：芽孢杆菌、小球菌、棒状杆菌等细菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。
①提供无机盐；
②调节pH。
注意事项：取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。
（1）土壤取样
① 取样地点要求：酸碱度接近中性的潮湿土壤。细菌适宜在该环境中生长。
② 取样过程：铲去表层土（一般3cm左右）。细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。
4.土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
（3）实验步骤：
（2）制备培养基
①选择培养基：
以尿素为唯一氮源
②牛肉膏蛋白胨培养基：
作为对照组，来判断选择培养基是否具有选择作用
①不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间适于计数的平板。
4.土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
（3）实验步骤：
① 测细菌数：一般用104、105、106稀释液进行平板培养。
② 测放线菌数：一般用103、104、105稀释液。
③ 测真菌数：一般用102、103、104稀释液。
（3）样品的稀释与涂布平板
4.土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
（3）实验步骤：
在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？
选用稀释范围更大的稀释液进行平板培养；
例如可以将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布平板上培养，以保证能从中选择出菌落数为30～300的平板进行计算。
（3）样品的稀释与涂布平板
②每个浓度至少设置4个平板：
1、2、3平板是选择培养基（实验组，三个重复），
4为牛肉膏蛋白胨培养基（对照组，来判断选择培养基是否具有选择作用）；
（3）样品的稀释与涂布平板
4.土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
（3）实验步骤：
不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基；
以验证培养基中是否含有杂菌。
问题：另外，整个实验还要设置2个平板，是哪两个？目的？
① 培养条件：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d。
② 观察：每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
③ 一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。
4.土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
（3）实验步骤：
（3）样品的稀释与涂布平板
如果1个平板的计数结果与另 2个相差太远(不在30~300范围内)，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。
4.土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
（3）实验步骤：
（3）样品的稀释与涂布平板
③注意事项：
本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等；
4.土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
注意事项：
1.10g土样加入盛有90mL无菌水中后，已稀释10倍，在计算时，不要忽略；
2.由于使用的是选择培养基，所以一般情况下，获得的单菌落即目的菌，但因为有些微生物可以利用目的菌的代谢产物来生长繁殖，所以还需要进一步验证；
3.过程中所有操作都应在酒精灯火焰旁进行；
4.将涂布器从酒精中取出时，要让多余
的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰
上灼烧；不要将过热的涂布器放在盛有
酒精的烧杯中，以免引燃酒精。
①培养基的制作是否合格
如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。
空白对照
稀释104倍
稀释105倍
稀释106倍
5.结果与评价
2.微生物的选择培养
②接种操作是否符合无菌要求
如果培养基上生长的菌落的颜色、形
状、大小基本一致，并符合目的菌的菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。
1.说出以下现象对应的结果分析：
现象 分析
未涂布培养基上无菌落生长
未涂布培养基上有菌落生长
牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目明显多于选择培养基上的菌落数木
培养基未被杂菌污染
培养基被杂菌污染
选择培养基具有选择作用
5.结果与评价
2.微生物的选择培养
2.你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数是多少？与其他同学统计的结果接近吗？如果差异很大,可能是什么原因引起的？
如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。
1. 研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌。判断下列相关表述是否正确。
（1）这种培养基是一种选择培养基。（ ）
（2）利用这种石油降解菌可以降解石油。修复土壤。（ ）
（3）相对于未被污染的土壤,从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌。（ ）
√
√
√
2.用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数,原因是（ ）
A. 菌落中的细菌数目是固定的
B. 平板上的一个菌落就是一个细菌
C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同
D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌
D
1.反刍（chú）动物，如牛和羊具有特殊的器官一瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设计一个实验从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。
反刍动物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基，还应该参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。
2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中 40% ~ 60% 能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用精杆等生产酒精，用纤维索酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维索被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈(如下图所示)。
（2）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？
提示：纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中，采集土样时，可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。
2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中 40% ~ 60% 能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用精杆等生产酒精，用纤维索酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维索被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈(如下图所示)。
（3）有同学说,可以把滤纸埋在土壤中,经过一段时间后,再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。
提示：这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境,腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。

展开更多......

收起↑