资源简介

(共19张PPT)
发酵工程
传统发酵技术的应用
微生物的培养技术及应用
发酵工程及其应用
微生物的基本培养技术
微生物的培养和计数
第2节 微生物的培养技术及应用
第二课时 微生物的选择培养和计数
本节聚焦
1.怎样运用生物与环境相适应的观点来理解选择
培养的原理？
2. 如何通过调整培养基的配方来有目的地培养某
种微生物？
3.测定微生物数量的常用方法有哪些？
自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。
杂菌群
该怎么办呢？
科学家们应用选择性培养基解决了这一难题。
选择培养基
美国黄石国家公园的一个热泉
1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌，进而提取出耐高温的DNA聚合酶。
聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外扩增DNA片段的技术，此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。
为什么水生栖热菌能从热泉中筛选出来呢？
因为水生栖热菌能在70-80℃的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
实验室微生物的筛选时，可人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。
加入青霉素：
不加氮源：
不加含碳有机物：
——分离出酵母菌、霉菌等真菌
(青霉素能杀死细菌、放线菌)
——分离出固氮菌
——分离出自养型微生物
举例几种选择培养基
如果分离土壤中分解尿素的细菌，该怎么设计呢？
思考-讨论
选择培养基配方的设计
尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素被土壤中某些细菌分解成NH3,再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。
这些细菌之所以能分解尿素，是因为能合成脲酶，来催化尿素分解。
尿素分子模型
讨论：
1、你如何设计培养基配方，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来？
培养基添加尿素作唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素、缺乏氮源而不能生长发育繁殖，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。
2、该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
牛肉膏 5.0g
蛋白胨 10.0g
NaCl 5.0g
琼脂 20.0g
蒸馏水 定容到1000ml
KH2PO4 1.4g
NaH2PO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素CO(NH2)2 1.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 定容到1000ml
配方一：培养细菌
配方二：培养可以分解尿素的细菌
1、从物理性质看此培养基属于哪类？从用途上属于哪类培养基？
固体培养基
配方二是以尿素作唯一氮源的选择培养基
2、此培养基中共有哪些成分？
碳源、氮源、水、无机盐
3.KH2PO4和Na2HPO4的作用是：
①提供无机盐；
②调节pH。
思考：
1.在以尿素作为唯一氮源的培养基中分离出的微生物都是能分解尿素的吗？
因为有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物进行生长繁殖。
不一定。
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。
2.怎么鉴定该细菌能够分解尿素？
CO(NH2)2
脲酶
+ H2O
+ CO2
2NH3
微生物的选择培养
如果想知道1g土壤中有多少能分解尿素的细菌，还需对土壤菌液进行稀释及科学的微生物数量测定方法---稀释涂布平板法。
稀释涂布平板法
是将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
方法步骤：
1.制备培养基
2.土壤取样
从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。
制备以尿素为唯一氮源的选择培养基
3.样品梯度稀释
微量 移液器
在火焰旁称取10g土样，加入盛有90ml无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成稀释10倍的土壤菌液。
分别取1ml上清液，加入盛有9ml无菌水的试管中，制成不同稀释倍数的菌液。
取6支试管，分别加入9ml无菌水。
6支试管，分别加入9ml无菌水
1ml
102
1ml
103
1ml
104
1ml
105
1ml
106
1ml
107
稀释10倍菌液
101
土壤10g
1、将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中
2、取少量稀释液（不超过0.1ml ），滴加到培养基表面
3、将沾有少量酒精的涂布器在火焰上灼烧，待酒精燃尽后，冷却8-10s。
4、用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀
各梯度分别涂布3个平板，1个不涂布作空白对照
4.取样涂布平板
稀释103倍
稀释104倍
稀释105倍
空白对照
恒温培养箱
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入37℃恒温箱中
培养1～2d
5.培养与观察
微生物的数量测定
稀释涂布平板法除可以用于分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目
原理：
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，可推测出样品中大约有多少活菌。
计数原则：
（1）选择30-300个菌落的平板进行计数；
（2）每个稀释度至少取3个平板取其平均值；
（3）统计的菌落往往比活菌的实际数目低；
（4）统计的结果一般用菌落数而不是活菌数；
（5）恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。
间接计数法
计算：
每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M
其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，
M代表稀释倍数。
甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？
（80+90+100）/3
0.1
× 105 =9 ×107个
显微镜直接计数
原理：
这种方法是利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量
每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数
缺点：
不能区分死菌与活菌；
个体小的细菌在显微镜下难以观察；
不适于对运动细菌的计数
选择培养基
特殊成分
加入某种化学物质
目的
抑制其他微生物生长，促进目的微生物的生长
用途
举例
鉴别培养基
加入某种指示剂
发生特定颜色反应
分离出特定微生物
鉴别不同的微生物
用尿素作唯一氮源的培养基来筛选尿素分解菌
伊红—美蓝培养基
鉴定大肠杆菌
选择培养基和鉴别培养基
拓展：
项目 优点 缺点
平板划线法
稀释涂布平板法
平板划线法和稀释涂布平板法都可以分离菌种，后者可以用于微生物的计数，所用培养基为固体培养基
可以观察菌落特征，对混合菌进行分离
不能计数
可以计数，可以观察菌落特征
吸收量较小，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延
课堂小结
微生物的实验室培养
选择培养基
微生物的选择培养：
微生物的数量测定
概念
选择培养基配方的设计
稀释涂布平板法
间接计数法
直接计数法

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