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(共30张PPT)
第3章 基 因 工 程
为什么传统的杂交育种方法培育不出抗虫棉，
基因工程却可以呢？
基因工程是如何进行操作的？
它给我们的生产和生活带来了怎样的影响？
我国成为世界第二个拥有抗虫基因自主知识产权的国家！
　　指按照人们的愿望, 通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作DNA重组技术。
基因工程
操作环境：
操作对象：
操作水平：
工程实质：
工程产物：
生物体外
基因
DNA分子水平
人类需要的基因产物
基因重组
基因工程发展历程
1944年艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物个体间转移。
1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。截至19666年，64个密码子均被破译成功。
1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性核酸内切酶（简称限制酶）
1972年，伯格首先在体外进行了DNA的改造，成功构建了第一个体外重组DNA分子。
1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成为世界各国研究和投资开发的热点。
1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。
1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。
20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。
1973年，科学家证明了质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，并实现了物种间的基因交流。至此，基因工程正式问世。
1985年，穆里斯等人发明PCR,为获取目的基因提供了有效手段。
1. 不同生物的基因为什么能拼接？
2. 外源基因为什么能在受体细胞中表达？
(1)DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。
(2)双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。
(1)基因是控制生物性状的独立遗传单位。
(2)遗传信息的传递都遵循中心法则。
(3)生物界共用一套遗传密码。
相同的遗传信息在不同的生物体内表达出相同的蛋白质。
基因工程诞生的理论基础
基
因
工
程
重组DNA技术的基本工具
基因工程的基本操作程序
基因工程的应用
蛋白质工程的原理和应用
第1节 重组DNA技术的基本工具
（第1课时）
转基因番木瓜
非转基因番木瓜
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵害。当番木瓜受到这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。
从社会中来
DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？
DNA重组技术的基本工具：
“分子手术刀”—— 限制性核酸内切酶
“分子缝合针”—— DNA连接酶
“分子运输车”—— 基因进入受体细胞的载体
本节聚焦
1、基因工程中需要哪些基本工具？
2、这些基本工具的作用分别是什么？
3、基因工程载体需要具备什么条件？
（一）分子手术刀---限制性内切核酸酶（限制酶）
来源：
主要从原核生物中分离纯化来的
特点 :
作用部位:
特定切点上的磷酸二酯键
结果：
形成黏性末端、平末端
种类：
数千种
能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列,并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
①原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原体的侵害。②限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中起到切割外源DNA、使之失效的作用，从而达到保护自身的目的。③因为限制酶识别DNA的特定核苷酸序列，所以不会伤害到自身的遗传物质。
为什么原核生物中存在限制酶？这些酶的作用是什么？
为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？
通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。
1分子磷酸
1分子脱氧核糖
1分子含氮碱基
DNA分子的基本组成单位
1分子脱氧核苷酸 = + +_______________
碱 基
A
G
C
T
磷酸
脱氧
核糖
1
2
5
3
4
如何理解限制酶对双链DNA分子的特异性识别和切割？
3',5'-磷酸二酯键
每相邻两个脱氧核苷酸之间通过形成3ˊ,5ˊ-磷酸二酯键连接，多个脱氧核苷酸形成一条长链。
OH
OH
脱去H2O，形成磷酸二酯键
仔细观察以下四种限制酶识别的特定序列有何特点？
EcoRⅠ
……G-A-A-T-T-C……
……C-T-T-A-A-G……
HindⅢ
……A-A-G-C-T-T……
……T-T-C-G-A-A……
BamHⅠ
……G-G-A-T-C-C……
……C-C-T-A-G-G……
SmaⅠ
……C-C-C-G-G-G……
……G-G-G-C-C-C……
回文序列
大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成
两种常用的限制酶：
EcoRⅠ和SmaⅠ
试一试
下面哪项不具有限制酶识别序列的特征（ ）
A．GAATTC B．GGGGCCCC
CTTAAG CCCCGGGG
C．CTGCAG D．CTAAATC
GACGTC GATTTAG
D
基因的针线：DNA连接酶
G A A T T C
C T T A A G
G A A T T C
C T T A A G
G
C T T A A
A A T T C
G
G
C T T A A
A A T T C
G
G
C T T A A
A A T T C
G
用EcoRI切割
DNA片段1
DNA片段2
重组DNA片段
这两种酶连接什么样的末端？一样吗？
（二）分子缝合针---DNA连接酶
作用：
种类：
①E.coli DNA连接酶 ②T4 DNA连接酶
将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 。
思考
类型 E·coli DNA连接酶 T4DNA连接酶
来源 ____________ ____________
功能 只缝合____________ 缝合____________和____________
结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_________________ 大肠杆菌
T4噬菌体
黏性末端
黏性末端
平末端（效率低）
磷酸二酯键
判断对错
（1）两个DNA片段的黏性末端必须互补才能通过DNA连接酶连接
起来。
（2）T4DNA连接酶连接平末端的效率和连接黏性末端的效率相同。
（3）DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事。
因为黏性末端的碱基是互补的，在连接时，黏性末端可以通过碱基互补配对，加快DNA连接酶的连接速度，而平末端则不能。
DNA连接酶 DNA聚合酶
相同点 作用实质 化学本质 不 同 点 模板
作用对象
作用结果
用途
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质
不需要
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
形成DNA的一条链
基因工程
DNA复制
只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
（三）分子运输车---运载体
项目 内容
载体类型
作用
条件
质粒、噬菌体、动植物病毒等
将外源基因送入受体细胞的工具
假如目的基因导入受体细胞后不能复制，转基因生物能产生预想的性状吗？
霍乱弧菌的质粒有多个限制酶切点，你会用它做载体吗？
如果载体没有切割位点将会怎样？
如何确定目的基因是否进入受体细胞中了？
对受体细胞无害
有一个或多个限制酶切割位点，供外源基因插入
能够在宿主细胞中复制并稳定地保存
具有特殊的标记基因，供重组DNA的鉴定和选择
质粒——基因工程中常用的基因载体
质粒是基因工程常用的载体，一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞核或原核细胞拟核之外，能自我复制的小型环状双链DNA分子，对宿主细胞没有影响，主要存在于细菌和酵母菌体内。其中最常用的是大肠杆菌质粒。
真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的
AATTCGGCATAC…
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
GCCGTATG…
目的基因
… TCCTAG
… AGGATCTTAA
AATTCCATAC …
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
GGTATG …
重组DNA分子的模拟操作
AATTCGGCATAC…
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
目的基因
… TCCTAG
… AGGATCTTAA
AATTCCATAC …
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
GGTATG …
GCCGTATG…
1、选目的基因两端和运载体都有的酶切位点；
2、所选酶切位点不能破坏目的基因以及标记基因
规律：---选择酶切位点的原则：
Hind III和EcoR I
下列操作中选用哪种限制酶切割来构建重组质粒？
限制酶
DNA连接酶
载体
①对受体细胞无害；
②有一个至多个限制酶切割位点；
③有特殊的标记基因；
④能自我复制或能整合到宿主DNA上。
质粒、噬菌体、动植物病毒等
课堂小结
基因工程的基本工具
作为载体的条件
种类:
磷酸二酯键
来源：
主要来源于原核生物
特点：
作用部位：
具有专一性
结果：
形成黏性末端或平末端
连接部位：磷酸二酯键
种类： E.coliDNA连接酶、T4 DNA连接酶
作用： 把两条双链DNA片段拼接起来

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