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(共41张PPT)
微生物的选择培养和计数
预习检查
1.选择培养基
(1)自然界中目的菌的筛选
①实例：聚合酶链式反应(PCR)中用到的耐高温的DNA聚合酶，就是从热泉中筛选出的_____________中提取出来的。
②依据：水生栖热菌能在____________的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
水生栖热菌
70～80℃
小组长检查，课代表收集问题
(2)实验室中目的菌的筛选
①原理：人为提供有利于________生长的条件(包括营养、温度和pH等)，同时___________其他微生物的生长。
②方法：利用选择培养基分离。
选择培养基：允许__________的微生物生长，同时____________其他种类微生物生长的培养基。
目的菌
抑制或阻止
特定种类
抑制或阻止
2.微生物的选择培养
(1)方法：对样品进行充分稀释，然后将_______涂布到制备好的______培养基上。
(2)稀释涂布平板法的操作过程
①系列稀释操作
菌液
选择
a.编号为1×102～1×107试管中分别盛有9 mL________。
b.将____ g土样加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。
c.取1 mL上清液加入盛有9 mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
无菌水
10
涂布器灭菌：将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、
涂布器______后，再进行涂布
②涂布平板操作
取菌液：取0.1 mL菌液，滴加到_______表面
涂布器消毒：将涂布器浸在盛有_____的烧杯中
涂布平板：用涂布器将_____均匀地涂布在培养基表
面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀
培养基
酒精
冷却
菌液
(3)培养：待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板______，放入30～37℃的______________中培养1～2 d。
倒置
恒温培养箱
3.微生物的数量测定
(1)稀释涂布平板法
①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个______。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少______。
②计数原则：一般选择菌落数为_________的平板进行计数。样品的稀释度将直接影响平板上的菌落数目，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养。在同一稀释度下，应至少对____个平板进行重复计数，然后求出_______。
活菌
活菌
30～300
3
平均值
③计算公式
每克样品中的菌株数＝
×稀释倍数
(2)显微镜直接计数法
一种常用的、快速直观的测定微生物数量的方法。该方法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量，统计的结果一般是________________的总和。
活菌数和死菌数
注意：显微镜直接计数法本身不能区分细菌的死活，因此一般用来统计总菌数。但是，通过一定的辅助处理，可以实现活菌计数，如在计数前用台盼蓝染液进行染色，可以通过统计无色细胞的个数来对活菌进行计数。
(1)以尿素为唯一氮源的培养基是选择培养基(　　)
(2)脲酶能催化尿素分解产生N2，N2可作为细菌生长的氮源(　　)
(3)利用显微镜直接计数法统计的细菌数量就是活菌的数量(　　)
×
√
×
1.实验设计
(1)土壤取样
①土壤要求：酸碱度接近中性且潮湿。
②取样部位：距地表约___________的土壤层。
(2)样品的稀释
测定土壤中细菌的数量，一般选用______________________倍稀释的稀释液进行平板培养，当第一次做这个实验时可以将稀释的范围放___一点。
3～8 cm
1×104、1×105和1×106
宽
(3)微生物的培养与观察
①培养：根据不同微生物的需要，控制适宜的培养_____和培养时间。细菌一般在_________ ℃的温度下培养______ d。
②观察
a.观察方法：每隔____h统计一次菌落数目，选取______________时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而遗漏部分菌落。
b.记录菌落的特征：包括菌落的_______、_______和______等。
30～37
1～2
24
菌落数目稳定
形状
大小
颜色
温度
2.操作提示
(1)无菌操作：取土样的用具在使用前都需要_______。
(2)做好标记：本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的________等。
(3)制定计划：对于耗时较长的生物实验，需要事先规划时间，以便提高实验效率，在操作时有条不紊。
灭菌
稀释度
(1)测定不同微生物数量时，接种的土壤稀释液的稀释度相同(　　)
×
(2)利用稀释涂布平板法统计菌落数目时，统计的菌落数就是活菌的实际数(　　)
(3)菌落特征是鉴别菌种的重要依据(　　)
×
√
任务一：微生物的选择培养和计数
1.通常1g土壤中有几亿到几百亿个土壤微生物，其中，细菌的数量最多，能分解尿素的细菌是其中的一部分。如何设计培养基的配方，从而将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来？
核心探讨
提示　设计一种选择培养基，以尿素作为唯一氮源，可以将分解尿素的细菌分离出来。
2.用平板划线法接种培养结果的图片如右图。请结合图片分析，平板划线法能否达到对细菌进行计数的目的？为什么？
提示　不能；平板划线法最开始的划
线很可能菌类会长成一片，导致无法
计数，此外灼烧接种环的时候也会杀死一部分菌类。
3.当菌液稀释倍数足够高时，培养基表面生长的一个单菌落来源于一个活菌。用稀释涂布平板法接种培养的结果如图所示。与平板划线法相比，为什么稀释涂布平板法可以用于细菌的计数？
提示　稀释涂布平板法会进行等比稀释，
在合适的稀释倍数下，均匀涂布得到的
菌落互不接触，可以确定菌落的密度，再通过计算可以得知原液中的活细菌数。
4.请计算：4号试管的结果表明每克土壤中的活菌数约为___________个。
1.1×108
5.通过稀释涂布平板法统计的细菌的数目与它的实际数目相同吗？为什么？
提示　不相同，统计的细菌数往往比活菌实际数目少。因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
6.请完善表格中稀释涂布平板法和显微镜直接计数法的比较。
项目 稀释涂布平板法 显微镜直接计数法
主要用具 培养基等 显微镜、___________________
_______等
计数依据 培养基上的______数 菌株本身
优点 计数的都是活菌 计数方便、操作简单
缺点 操作复杂、有一定误差 死菌、活菌都计数在内
血细胞计数板或细菌
计数板
菌落
核心归纳
类型 条件 分离得到的菌种
改变培养条件 70～80℃的高温 水生栖热菌
添加某种化学物质 加入青霉素 酵母菌、霉菌等真菌
高浓度食盐 金黄色葡萄球菌
特殊碳源、氮源 石油是唯一碳源 能消除石油污染的微生物
营养缺陷 不加碳源 自养型微生物
不加氮源 固氮菌
1.选择培养基的类型
核心归纳
项目 平板划线法 稀释涂布平板法
主要步骤 接种环在固体培养基表面连续划线 等比稀释操作和涂布平板操作
接种工具 接种环 涂布器
单菌落 的获得 从最后划线的区域挑取 稀释度合适，整个平板上都可找到单菌落
用途 分离纯化菌种，获得单菌落 ①分离纯化菌种，获得单菌落；
②用于计数
2.两种纯化方法的比较
菌落分布
共同点 都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可用于观察菌落特征 核心归纳
任务二：土壤中分解尿素的细菌的分离、计数与鉴定
1.测定土壤中细菌的总量和能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？为什么？
提示　不相同；因为土壤中能分解尿素的细菌的数量比细菌的总量要少。
2.甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。
(1)甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230，该同学的统计结果_________(填“可靠”或“不可靠”)。若不可靠，应如何改进？
提示　为增加实验的说服力与准确性，应设置重复实验，在同一稀释度下至少涂布3个平板，统计结果后计算平均值。
不可靠
(2)乙同学在该浓度下涂布了3个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学将21舍去，然后取平均值。该同学对实验结果的处理_________(填“合理”或“不合理”)。微生物计数时，如果实验中出现重复实验的结果差别很大的情况，应_______________________________
___________________________________________________。
不合理
分析实验过程中可能的影响因素，
从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因
3.尝试完成下表中对微生物的分离与计数实验结果的分析。
目的 现象 结论
是否有杂菌污染的判断 ___________________________ 未被杂菌污染
培养物中菌落形态多样，菌落数偏高 培养物中混入其他杂菌
选择培养基是否起筛选作用 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目_____选择培养基上的数目 选择培养基具有筛选作用
对照组的培养基中无菌落生长
大于
4.利用尿素作为唯一氮源的培养基分离出的微生物都是能分解尿素的微生物吗？并说明理由。
提示　不一定；因为有些微生物可以利用能分解尿素的细菌的代谢物进行生长繁殖。
5.细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发生了该化学反应，进而判断该菌是否为尿素分解菌。依据以上原理，如何对分离得到的微生物是否是分解尿素的细菌作进一步鉴定？
提示　在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，接种并培养初步筛选的菌种，若菌落周围出现红色环带，则可说明该菌种能够分解尿素。
核心归纳
项目 选择培养基 鉴别培养基
特殊成分 加入某种化学物质 加入某种指示剂或化学药品
目的 抑制或阻止其他微生物生长，促进目的微生物生长 与微生物的代谢物或培养基中的成分发生特定反应
用途 培养、分离出特定微生物 鉴别不同的微生物
选择培养基与鉴别培养基
举例 培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌生长；用以尿素作为唯一氮源的培养基来培养尿素分解菌 可用伊红—亚甲蓝琼脂培养基鉴定饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有，菌落呈深紫色，并有金属光泽)
核心归纳
选择培养基与鉴别培养基
1.如图是研究人员从红棕壤中筛选高效分解尿素的细菌的过程示意图。下列有关叙述错误的是
典例分析
A.在配制步骤②③的培养基时，应先调pH后湿热灭菌
B.步骤③纯化分解尿素的细菌的原理是将聚集的细菌分散，以获得单菌落
C.步骤③采用稀释涂布平板法接种，并需向牛肉膏蛋白胨培养基中加入尿素
D.步骤④挑取③中不同种的菌落分别接种，比较不同种细菌分解尿素的能力
√
步骤③筛选分解尿素的细菌的培养基中，应以尿素为唯一氮源，不能再含有其他氮源，C错误。
2.如图是纯化微生物时采用的两种接种方法接种后培养的效果图，下列相关叙述正确的是

A.图甲三个平板中所用培养液的稀释倍数相同
B.图甲、乙均适合分离微生物，但乙不适合对微生物进行计数
C.图甲、图乙所用的接种工具分别是接种环和涂布器
D.图乙每次划线应从同一起点开始以便使聚集的菌种逐步稀释获得单菌落
√
根据图甲中三个平板的菌落密度可知，三个平板中所用培养液的稀释倍数不同，A错误；
图甲、乙中若均为选择培养基，均可用于分离微生物，图乙是平板划线法接种后的结果，不适合对微生物进行计数，B正确；
稀释涂布平板法接种使用涂布器，平板划线法接种使用接种环，C错误；
图乙每次划线应从上一次划线的末端开始，以便使聚集的菌种逐步稀释获得单菌落，D错误。
3.(多选)下列关于“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验操作的叙述，正确的是
A.利用稀释涂布平板法准确估计菌落数目的关键是有恰当的稀释度
B.若要判断选择培养基是否起到了选择作用，需要设置未接种的牛肉膏
蛋白胨培养基作为对照
C.该实验应采用稀释涂布平板法
D.用以尿素为唯一氮源且添加了酸碱缓冲剂的培养基来培养该细菌后会
使酚红指示剂变红
√
√
利用稀释涂布平板法估算菌落数目的关键是有恰当的稀释度，若稀释倍数太低、菌落太多，会连在一起，稀释倍数太高，平板上菌落数目过少，都不宜进行计数，A正确；
若要判断选择培养基是否起到了选择作用，需设置接种在没有选择作用的细菌通用的牛肉膏蛋白胨培养基上培养作为对照，B错误；
分解尿素的细菌能合成脲酶，将尿素分解产生氨，使培养基的碱性增强，用以尿素为唯一氮源且添加了酸碱缓冲剂的培养基来培养该细菌，能维持pH稳定，不会使酚红指示剂变红，D错误。
4.(2023·江苏连云港高二期末)在做“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”的实验时，甲同学从对应稀释倍数为106的培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只筛选出大约50个菌落。下列有关叙述错误的是
A.甲同学出现这种结果的原因可能是土样不同，也可能是操作过程出了
问题
B.将甲同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养作为空白对照，
可以证明培养基是否受到污染
C.让其他同学用与甲同学一样的土壤进行实验，如果结果与甲同学一致，
则可以证明甲同学无误
D.B、C选项的实验思路都遵循了实验的对照原则
√
B选项的实验思路遵循了实验的对照原则，C选项的实验思路遵循了实验的重复原则，D错误。
网络构建

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