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生物学（新人教版）
生物技术与工程
第一章第2节
微生物的选择培养和计数
01
选择培养基
1.科学实例：寻找耐高温的DNA聚合酶
（1）1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌，进而从这种菌中提取出耐高温的DNA聚合酶。
（2）聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外扩增DNA片段的技术，此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。
筛选原因：水生栖热菌能在70-80℃高温条件下生存，而绝大多数微生物
在此条件下不能生存。
2.概念：
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基。
3.筛选原理：
根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
耐寒微生物
耐热微生物
石油分解菌
有利于目的菌生长的条件有哪些？
营养、温度和pH等
培养基中加氨苄青霉素
培养基应有菌落
没有氨苄青霉素抗性的细菌被淘汰
4.实验室中微生物的筛选：
分离酵母菌、霉菌等真菌
分离固氮菌
分离自养型微生物
④加高浓度食盐
金黄色葡萄球菌
⑤金黄色葡萄球菌
能消除石油污染的微生物
③不加含碳有机物的无碳培养基
②不加氮源的无氮培养基
①加入青霉素的培养基
思考：那么如果让你分离土壤中分解尿素的细菌，你应该怎么设计呢？
02
微生物的选择培养
1g土壤中有多少能分解尿素的细菌
原理：通过对土样进行充分稀释，再将菌液涂布到制备好的培养基上，即可得到能分解尿素的细菌的纯培养物。
尿素的立体结构
1.选择培养基的作用
稀释涂布平板法：必须要对土样充分稀释后，然后将菌液涂布到制备好的选择培养基上。
2.微生物选择培养获取纯培养物的方法
分离并计数某种微生物的数量（例如，能分解尿素的细菌）。
3.稀释涂布平板法的操作过程
①铲取土样，将样品装入纸袋中
②将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
1mL
1ⅹ10
90mL无菌水
1ⅹ107
1ⅹ105
1ⅹ106
1ⅹ103
1ⅹ102
1ⅹ104
1mL
1mL
1mL
1mL
9mL无菌水
1mL
③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。
④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，培养
03
微生物的数量测定
1．测定依据
(1)当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
(2)通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
2．操作过程
(1)选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数为30～300、适于计数的平板。
(2)在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。
3.结果分析：
①统计的菌落数往往比活菌的实际数目____；
原因：__________________________________________
______________
②统计结果一般用_______而不是用活菌数来表示；
少
当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
菌落数
4.计算公式：
每g样品中的菌落数＝(C÷V)×M
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)
M代表稀释倍数
例：某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL) ( )
A. 2.34×108 B. 2.34×109 C. 234 D. 23.4
B
练习：下图为“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验中样品稀释示意图。据图分析，每克土壤中的菌株数约为多少？
【提示】每克土壤中的菌株数约为1.7×109个。
不能区分死菌与活菌；
个体小的细菌在显微镜下难以观察；
直接计数 —计数板计数法
①原理：利用细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。
②缺点：
04
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
琼脂 15.0g
蒸馏水 1000ml
①原理：绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
1.培养基的制备
②配方：
KH2PO4和Na2HPO4的作用是：
①提供无机盐；
②调节pH。
常见的分解尿素的微生物：芽孢杆菌、小球菌、棒状杆菌等细菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。
细菌宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大部分分布在距地表3-8cm的土壤层。铲去表层土3cm左右，取样，将样品装入事先准备好的信封中。
2.实验设计
（1）土壤取样
（2）样品的稀释
不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间，适于计数的平板。
测细菌数：一般用104、105、106稀释液
测放线菌：一般用103、104、105稀释液
测真菌数：一般用102、103、104稀释液
①铲取土样，将样品装入纸袋中
②将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
1mL
1ⅹ10
90mL无菌水
1ⅹ107
1ⅹ105
1ⅹ106
1ⅹ103
1ⅹ102
1ⅹ104
1mL
1mL
1mL
1mL
9mL无菌水
1mL
（3）稀释涂布平板法接种
③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。
④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，培养
①不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d。
③一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。
②每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
（4）微生物的培养与观察
（5）结果分析
现象
分析
未涂布培养基上无菌落生长
未涂布培养基上有菌落生长
牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目明显多于选择培养基上的菌落数目
培养基未被杂菌污染
培养基被杂菌污染
选择培养基具有选择作用
①结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。
②你是否获得了某一稀释度下菌落数为30～300的平板 在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近
③你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数是多少 与其他同学统计的结果接近吗 如果差异很大，可能是什么原因引起的
如果没有接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。如果接种后的完全培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基筛选出了一些尿素分解菌。
如果得到了两个或多个菌落数为30～300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。
如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。
(6)操作提示
②无菌操作
③做好标记
本实验使用的平板和试管比较多，为避免混淆，使用前要做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。
④制定计划
对于耗时较长的生物实验，要事先规划时间，以便提高工作效率，在操作时更加有条不紊。
①不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。
a、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。
b、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入
锥形瓶中，塞好棉塞。
c、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。
微生物的数量测定
选择培养基的作用
微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法
微
生
物
的
选
择
培
养
和
计
数
选择培养基
微生物的选择培养
科学实例
筛选原则
选择培养基的概念及举例
稀释涂布平板法的操作过程
间接计数法 — 稀释涂布平板法
直接计数 —计数板计数法
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
培养基的制备
实验设计
（1）土壤取样
（2）样品的稀释
（3）稀释涂布平板法接种
（4）微生物的培养与观察
实验设计
【课堂小结】

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