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第2节 微生物的培养技术及应用
二 微生物的选择培养和计数1
第1章 发酵工程
高压蒸汽灭菌
液体培养基
学习目标 核心素养
1.举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物。 2．概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法。 1.生命观念：各类微生物都能适应其生活环境。
2．科学思维：根据微生物的代谢类型配制选择培养基。
3．科学探究：讨论土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的方法。
自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，更难实现，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。该怎么办？
二、微生物的选择培养和计数
1、科学实例：寻找耐高温的DNA聚合酶
筛选原因：因为热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物，使耐热
的Taq细菌保留下来。
PCR是一种在体外DNA复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。
（一）筛选原则
耐高温的酶
耐高温生物体
高温环境（热泉、火山口）
寻找
寻找
根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找
1973年，布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了耐热的Taq细菌，并分离到耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）。
二、微生物的选择培养和计数
2、实验室中微生物的筛选原理：
人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。
（二）选择培养基
允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。
二、微生物的选择培养和计数
培养基中加氨苄青霉素
具有氨苄青霉素抗性的菌落
没有氨苄青霉素抗性的细菌
培养基应有菌落
没有氨苄青霉素抗性的细菌被淘汰
怎样选择出抗氨苄青霉素能力的细菌
3.选择培养基类型：
（1）利用改变培养条件进行选择培养。
调节温度、pH等生长条件，只有适应的可以生长
（2）利用添加某种化学物质进行选择培养。
添加杀伤性物质，有抗性的可以生长，无抗性的死亡
（3）利用营养缺陷进行选择培养。
营养缺陷的微生物不能正常生长
（二）选择培养基
二、微生物的选择培养和计数
4.实例
（1）目的：分离酵母菌、霉菌等真菌，防止细菌生长
原理：青霉素能抑制细菌生长，对真菌无作用
配制：使用____________的培养基
（2）目的：分离固氮菌
原理：固氮微生物能利用空气中的氮气
配制：使用_______________________的培养基
（3）目的：分离自养型微生物
原理：自养型微生物能利用无机碳源
配制：使用___________________________的培养基
（4）目的：分离耐酸菌
原理：耐酸菌能在pH为酸性的条件下生长
配制：使用_______________的培养基
加入青霉素
不加氮源（以N2为氮源）
不加有机碳源（以CO2为碳源）
将pH调至酸性
尿素含氮量高，化学性质稳定，是一种重要的农业氮肥，尿素施入土壤后，被某些细菌分解成NH3，NH3再转化成NO3-、NH4+等才能被植物吸收。
土壤中尿素分解菌之所以能将尿素分解，是因为它们能合成脲酶：
CO(NH2)2+H2O
脲酶
CO2+2NH3
怎样才能将分解尿素的细菌从土壤中分离出来？
尿素的立体结构
在选择培养基中，以尿素作为唯一氮源，可以将分解尿素的细菌分离出来。
思考·讨论·选择培养基配方的设计
牛肉膏 5.0g
蛋白胨 10.0g
NaCl 5.0g
琼脂 20.0g
蒸馏水 定容到1000ml
KH2PO4 1.4g
NaH2PO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素CO(NH2)2 1.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 定容到1000ml
配方一：培养细菌
配方二：培养可以分解尿素的细菌
普通培养基与选择培养基的比较
1.从物理性质来讲，两者属于_____培养基，
判断依据是_____________________________________；
该类培养基的主要用途为___________________；
固体
添加了凝固剂琼脂，且比例为1.5%-2%
分离、鉴定、计数
普通培养基与选择培养基的比较
2.从用途上来讲，培养基二属于_____培养基，
目的是为了获得__________________；
选择
能分解尿素的微生物
牛肉膏 5.0g
蛋白胨 10.0g
NaCl 5.0g
琼脂 20.0g
蒸馏水 定容到1000ml
KH2PO4 1.4g
NaH2PO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素CO(NH2)2 1.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 定容到1000ml
配方一：培养细菌
配方二：培养可以分解尿素的细菌
普通培养基与选择培养基的比较
3.两种培养基共有的培养基成分有：_________________________；
培养基一的碳源为_______，氮源为_______；
培养基二的碳源为_______，氮源为_______；
碳源、氮源、无机盐、水
牛肉膏
蛋白胨
葡萄糖
尿素
牛肉膏 5.0g
蛋白胨 10.0g
NaCl 5.0g
琼脂 20.0g
蒸馏水 定容到1000ml
KH2PO4 1.4g
NaH2PO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素CO(NH2)2 1.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 定容到1000ml
配方一：培养细菌
配方二：培养可以分解尿素的细菌
怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？
应该设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）或完全培养基作为对照，若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数菌多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。
（三）微生物的选择培养
如果想知道1g土壤中有多少能分解尿素的细菌，还需要对土样进行适当的处理以及科学的测定微生物数量的方法——稀释涂布平板法。
稀释涂布平板法：将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
基本操作：（1）梯度稀释；
（2）涂布平板。
稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落。
二、微生物的选择培养和计数
1ⅹ107
1ⅹ105
1ⅹ106
1ⅹ103
1ⅹ102
1ⅹ104
9mL无菌水
稀释涂布平板法及其操作过程
①铲取土样，将样品装入纸袋中。
②将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
1ⅹ10
90mL无菌水
1mL
③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。
④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
1mL
1mL
1mL
1mL
1mL
10g
注意：移液管要经过灭菌，并且操作应在酒精灯火焰附近完成。
浸
滴
灼
涂
注意：
1.10g土样加入盛有90mL无菌水中后，已稀释10倍，再计算时，不要忽略；
2.由于使用的是选择培养基，所以一般情况下，获得的单菌落即目的菌，但因为有些微生物可以利用目的菌的代谢产物来生长繁殖，所以还需要进一步验证；
3.过程中所有操作都应在酒精灯火焰旁进行；
4.将涂布器从酒精中取出时，要让多于的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧；不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37℃的恒温培养箱中培养1～2d，在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落。
稀释涂布平板法除可以分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目。
（二）微生物的选择培养
培养与观察
恒温培养箱
二、微生物的选择培养和计数
一、微生物的选择培养
选择培养基
筛选原则
二、稀释涂布平板法及其操作过程
课堂总结
1.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（ 　　）
A. 较多的氮源物质
B. 较多的碳源物质
C. 青霉素类药物
D. 高浓度食盐
C
课堂练习
2.用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时,通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数,原因是（ ）
A.菌落中的细菌数目是固定的
B.平板上的一个菌落就是一个细菌数目相同
C.通过此方法统计的菌落数与活菌的实际
D.平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌
D

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