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第2节 微生物的培养技术及应用
二 微生物的选择培养和计数2
第1章 发酵工程
高压蒸汽灭菌
液体培养基
学习目标 核心素养
1.举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物。 2．概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法。 1.生命观念：各类微生物都能适应其生活环境。
2．科学思维：根据微生物的代谢类型配制选择培养基。
3．科学探究：讨论土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的方法。
（三）微生物的数量测定
1.间接计数法——稀释涂布平板法
（1）原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
样品的稀释度将直接影响平板上的菌落数目。
稀释103倍
稀释104倍
稀释105倍
空白对照
二、微生物的选择培养和计数
（三）微生物的数量测定
1.间接计数法——稀释涂布平板法
（2）计数原则
①一般选择菌落数为30～300的平板计数；
②在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。
③适当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。
分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作有误，需重新实验。
（3）结果分析：①统计的菌落数往往比活菌的实际数目少；
原因：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
②统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。
（三）微生物的数量测定
1.间接计数法——稀释涂布平板法
每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M
M代表稀释倍数；
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)
（4）计算公式：
某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL) ( )
A. 2.34×108 B. 2.34×109
C. 234 D. 23.4
B
例题1：
甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？
（80+90+100）/3
0.1
× 105 =9 ×107个
例题2：
每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数
缺点：
①统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和，不能区分死菌与活菌（数值偏大）。
②需要相对高的细菌浓度。
③不适于对运动细菌的计数
（1）原理：利用特定的细菌计数板或血细胞计数板在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。
细菌计数板可对细菌等较小的细胞进行观察和计数，血细胞计数板常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的观察和计数。
（三）微生物的数量测定
2.直接计数法——显微镜直接计数
（比例计数法）
待测样品
等量的已知含量的红细胞
混匀
涂抹
测定：
红细胞数目
细菌数目
计算单位体积内的细菌数目
　 将含已知数目的红细胞液体与待测的菌液按1：1均匀混合，在显微镜下数出各自的数目，然后求菌液中的细胞数目。
细菌
红细胞
显微镜直接计数是测定微生物的方法。
例：已知红细胞浓度为M个/mL，从体积为N mL的大肠杆菌培养液中取出大肠杆菌液与红细胞液等量均匀混合后，涂片，染色，镜检。在同一视野中发出有红细胞W个，大肠杆菌Y个，求NmL大肠杆培养液中大肠杆菌的个数X是多少？
X＝N×
M ×Y
W
(个)
观察到的红细胞平均数/观察到的细菌平均数＝红细胞含量/细菌含量
公 式
探究·实践·土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1.实验目的
（1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌。
（2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。
2.实验原理
绝大多数微生物都能利用
葡萄糖，但是只有能合成脲酶
的微生物才能分解尿素，利用
以尿素作为唯一氮源的选择培
养基，可以从土壤中分离出分
离尿素的细菌。
CO(NH2)2+H2O
脲酶
2NH3+CO2
组分 含量
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
琼脂 15.0g
H2O
定容至1000mL
3.实验步骤
（1）土壤取样
①取样地点要求：酸碱度接近中性的潮湿土壤。细菌适宜在该环境中生长。（细菌适宜在该环境中生长）
②取样过程：铲去表层土（一般3cm左右）。
（细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。）
取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。
应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。
探究·实践·土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
（2）制备培养基
①选择培养基
以尿素为唯一氮源
②牛肉膏蛋白胨培养基
作为对照组，来判断选择培养基是否具有选择作用。
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
琼脂 15.0g
蒸馏水 1000ml
3.实验步骤
探究·实践·土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
①每个浓度至少设置4个平板，1、2、3平板是选择培养基（实验组，三个重复），4为牛肉膏蛋白胨培养基（用以判断选择培养基是否具有选择作用）；
不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基；
以验证培养基中是否含有杂菌；
在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。
3.实验步骤
探究·实践·土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
（3）样品的稀释与涂布平板
另外，整个实验还要设置2个平板，是哪两个？目的？
①每个浓度至少设置4个平板，1、2、3平板是选择培养基（实验组，三个重复），4为牛肉膏蛋白胨培养基（用以判断选择培养基是否具有选择作用）；
在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。
3.实验步骤
探究·实践·土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
（3）样品的稀释与涂布平板
注意事项：本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等；
在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。
3.实验步骤
探究·实践·土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
（3）样品的稀释与涂布平板
②不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间适于计数的平板。
测细菌数：一般用104、105、106稀释液。
测放线菌：一般用103、104、105稀释液。
测真菌数：一般用102、103、104稀释液。
思考：在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中
选择出菌落数在30～300的平板进行计数？
选用稀释范围更大的稀释液进行平板培养；
例如可以将1×103至1×107倍稀释的稀释液分别涂布平板上培养，以保证能从中选择出菌落数为30-300的平板进行计算。
（4）微生物的培养与观察
①培养条件：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d。
②观察：每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
③一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。
3.实验步骤
探究·实践·土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1.结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。
2.你是否获得了某一稀释度下菌落数为30～300的平板 在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近
结果分析与评价
探究·实践·土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
如果没有接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。如果接种后的牛肉膏蛋白胨培养基（完全培养基）上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基筛选出了一些尿素分解菌。
如果得到了两个或多个菌落数为30～300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。
3.在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落，分析其原因。
原因：（1）土样不同（2）培养基污染或操作失误
小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。
方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验。如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。
方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。
结果分析与评价
探究·实践·土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
在以尿素作为唯一氮源的培养基中分离出的微生物都是能分解尿素的吗？
不一定。
因为有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物进行生长繁殖。
思考：
1.原理：细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发生了该化学反应，进而判断该菌是否为尿素分解细菌。
2.方法：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红：
（1）液体培养基可以直接看液体的变色情况；
（2）固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。
拓展——分解尿素细菌的进一步鉴定
CO(NH2)2+H2O
脲酶
CO2+2NH3
脲酶阴性
脲酶阳性
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。
拓展——分解尿素细菌的进一步鉴定
课堂总结
微生物的数量测定
选择培养基的作用
微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法
微
生
物
的
选
择
培
养
和
计
数
选择培养基
微生物的选择培养
科学实例
筛选原则
选择培养基的概念及举例
稀释涂布平板法的操作过程
间接计数法 — 稀释涂布平板法
直接计数 —计数板计数法
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
培养基的制备
实验设计
（1）土壤取样
（2）样品的稀释
（3）稀释涂布平板法接种
（4）微生物的培养与观察
实验设计
1.如表所示为某微生物培养基的配方。下列说法中不正确的是（ ）
A.此培养基属于固体培养基，其中的碳源是（CH2O）
B.配制培养基时，溶化后分装前必须要进行的是灭菌
C.接种时应在酒精灯火焰附近操作
D.若用该培养基选择培养纤维素分解菌，应除去青霉素，加入纤维素粉
课堂练习
成分 NaNO3 K2HPO4 KCl MgSO4·7H2O
含量 3g 1g 0.5g 0.5g
成分 FeSO4 （CH2O） H2O 青霉素
含量 0.01g 30g 定容至1000mL 0.1万单位
A
2.下图是研究人员从红棕壤
中筛选高效分解尿素细菌的
示意图,有关叙述错误的是
( )
A.在配制步骤②、③的培养基时,应先调pH值后高压蒸汽灭菌
B.步骤③纯化分解尿素的原理是将聚集的细菌分散,可以获得单细胞菌落
C.步骤③采用涂布平板法接种,并需向牛肉膏蛋白胨培养基中加入尿素
D.步骤④挑取③中不同种的菌落分别接种,比较细菌分解尿素的能力
C
课堂练板划线法 稀释涂布平板法
纯化原理
接种工具
单菌落的获得
用途
接种效果图
相同点
通过连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散。
将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释程度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养，以得到单菌落
接种环
涂布器
从最后划线的区域挑取
稀释度合适，整个平板上都可找到单菌落
分离纯化菌种，获得单菌落
①分离纯化菌种，获得单菌落②用于计数
①都能分离纯化菌种；②都是在固体培养基上进行的
两种纯培养方法的比较

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