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(共36张PPT)
细胞工程是指应用细胞生物学、分子生物学和发育生物学等多学科的原理和方法，通过细胞器、细胞或组织水平上的操作，有目的地获得特定的细胞、组织、器官、个体或其产品的一门综合性的生物工程。
原理和方法：
操作的水平：
目的：
分类：
细胞生物学、分子生物学和发育生物学等多学科。
细胞器、细胞或组织水平
获得特定的细胞、组织、器官、个体或其产品。
植物细胞工程、动物细胞工程
第二章 细胞工程
1902年，哈伯兰特提出了细胞全能性的理论，但相关的实验尝试没有成功。
1958年，斯图尔德等发现胡萝卜的体细胞可以分化为胚，为细胞全能性理论提供了强有力的支持。
1971年，卡尔森诱导烟草种间原生质体融合，获得了第一株体细胞种间杂种植株。
1964年，古哈等在培养毛曼陀罗的花药时，首次得到了由花药中的花粉粒发育而来的胚。
1960年，科金用真菌的纤维素酶分解番茄根的细胞壁，成功获得了原生质体。
1974年，土壤农杆菌的Ti质粒被发现，之后，该质粒应用于植物分子生物学领域，促进了植物细胞工程与分子生物学技术的紧密结合。
植物细胞工程
动物细胞工程（含胚胎工程）
1907年哈里森用一滴淋巴液成功培养了蝌蚪的神经元，首创了动物组织体外培养法
1951年张明觉等发现了哺乳动物精子的获能现象。
2014年世界上第一个用单细胞基因组测序进行遗传病筛查的试管婴儿在我国诞生。
2006年山中伸弥获得诱导多能干细胞。我国科学家用这种细胞培育出了小鼠。
1975年米尔斯坦和科勒等创立了单克隆抗体技术。
1959年卡试管家兔诞生。之后，多种试管动物相继出生。
1958年哈格登用非洲爪蟾进行体细胞核移植实验，成功培育出性成熟个体。同一时期，我国科学家童第周等开展了鱼类细胞核移植工作。
1996年世界上第一只体细胞克隆羊多莉在英国诞生，随后多种克隆动物相继问世。
2017年我国科学家首次培育了体细胞克隆猴。
1978年小鼠的桑葚胚被成功分割。科学家分割绵羊胚胎获得了同卵羔羊。
1981年埃文斯等成功分离和培养了小鼠的胚胎干细胞。
1890年希普将安哥拉兔的胚胎移入比利时兔的输卵管内，得到了两只安哥拉兔，这是世界上胚胎移植成功的首例。
第1节 植物细胞工程（第一课时）
第二章 细胞工程
学习目标 核心素养
1.阐明植物组织培养是在一定的条件下，将离体植物器官、组织和细胞在适宜的培养条件下诱导形成愈伤组织，并重新分化，最终形成完整植株的过程。 2．概述植物体细胞杂交是将不同来源的植物体细胞在一定的条件下融合成杂种细胞，继而培育新植物体的技术。 1.科学思维：说明植物组织培养和植物体细胞杂交的原理；以流程简图的形式表示植物组织培养技术和植物体细胞杂交的过程。
2．科学探究：查阅资料，尝试探究植物生长素和细胞分裂素使用比例对植物组织培养的影响。
问题探讨
“其芽葺葺，其叶青青，犹绿衣郎，挺节独立，可敬可慕。迨夫花开,凝晴瀼露,万态千妍,薰风自来,四坐芬郁,岂非入兰室乎!岂非有国香乎!”这是我国历史上第一部兰谱——《金漳兰谱》（宋·赵时庚）中对兰花的一段描述。从古至今，我国人民都把兰花看作高洁、典雅的象征，很多人喜欢兰花。但是，兰花种子通常发育不全，在自然条件下萌发率极低；传统分株繁殖的方法又存在繁殖周期长、繁殖率低等问题，如果靠自然繁殖，兰花的价格可想而知了。如何能让名贵的兰花大量、快速地繁殖，从而走入寻常百姓家呢？
国画作品—兰
利用植物组织培养技术可以大量、快速地培育兰花。兰花是观赏植物中最常见的一类依靠植物组织培养繁育种苗的植物，其组培苗的数量约占观赏植物组培苗总量的40%。
讨论：如何能让名贵的兰花大量、快速地繁殖，从而走入寻常百姓家呢？
原理：细胞的全能性
如何把某种植物的一块组织通过培养得到一株完整植株
植物组织培养
细胞经分裂和分化后，仍然具有产生完整生物体或分化成其他各种细胞的潜能。
(1)细胞具有全能性的原因（物质基础）：一般来说，生物体的细胞中都含有该物种的全套遗传物质都有发育成为完整个体所需的全部遗传信息。
(2)全能性大小：
①受精卵＞生殖细胞（卵细胞＞精子）＞体细胞；
②植物细胞＞动物细胞；③幼嫩的细胞＞衰老的细胞；
④分化程度低的细胞＞分化程度高的细胞；
⑤分裂能力强的细胞＞分裂能力弱的细胞。
一、植物组织培养技术
1.细胞的全能性：
细胞经分裂和分化后，仍然具有产生完整生物体或分化成其他各种细胞的潜能。
(3)生物体生长发育过程中细胞不表现全能性的原因（不离体的细胞无法表现出全能性的原因）：在特定的时间时间和空间条件下，细胞中的基因会选择性地表达（从而形成生物体的不同组织和器官）。
一、植物组织培养技术
1.细胞的全能性：
①芽原基的细胞只能发育为芽，叶原基的细胞只能发育为叶；
②神经干细胞分化形成各类神经细胞；
③造血干细胞可分化形成多种血细胞。
表现出全能性的例子：
①利用菊花茎段培养获得试管苗；
②利用胡萝卜的韧皮部细胞培养获得胡萝卜幼苗；
③受精卵发育成个体；
④通过花药离体培养，获得单倍体幼苗。
⑤蜜蜂的孤雌生殖中，卵细胞直接发育成雄蜂；
⑥胚胎干细胞可分化发育成为各种组织器官的细胞；
思考：
1.是不是所有的活细胞都具有全能性？
2.种子发育成植株体现了全能性了吗？
3.细胞具有的全能性一定能表现出来吗？
不是；
例如哺乳动物成熟的红细胞、植物成熟的筛管细胞。
没有；
植物种子种的胚已完成了早期发育，相当于新植物体的幼体，没有体现出细胞具有发育成完整植株的潜能。
不一定；
例如动物的体细胞。
一、植物组织培养技术
高度分化的植物组织细胞，如叶片和花瓣的细胞还能不能在适宜的条件下表现出全能性呢？
---多肉进行叶插繁殖
1.选取多肉上健康、饱满的叶片。
2.用剪刀切下整片叶片，切口要平滑、整齐。也可以直接用手轻轻掰下叶片。
3.平躺放在沙床上，叶片间隔相聚2~3厘米。
4.叶片切口不要有碰脏，摆放通风处2~3天，晾干。
5.待叶片晾干后移至半阴处养护。
6.约2~3周后生根，或从叶基处长出不定芽。
7.叶插成功
2.植物组织培养:
指将离体的植物器官、组织或细胞（称为外植体）等，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其形成完整植株的技术。
（1）原理：植物细胞的全能性。
(2)生殖方式：
无性生殖
(3)分裂方式：
有丝分裂
一、植物组织培养技术
2.植物组织培养:
指将离体的植物器官、组织或细胞（称为外植体）等，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其形成完整植株的技术。
一、植物组织培养技术
（4）过程:
外植体
脱分化
愈伤组织
再分化
根、芽
幼苗
完整植株
移栽成活
接种外植体
诱导愈伤组织
诱导生芽
诱导生根
移栽成活
2.植物组织培养:
一、植物组织培养技术
（4）过程:
外植体
脱分化
愈伤组织
再分化
根、芽
幼苗
完整植株
移栽成活
接种
外植体
诱导愈伤组织
诱导生芽
诱导生根
移栽成活
脱分化：在一定的激素和营养等条件的诱导下，已经分化的细胞失去其特有的结构和功能，转变成未分化的细胞的过程。
实质：已经分化的细胞失去其特有的结构和功能，转变为未分化的细胞。
结果：形成愈伤组织 *愈伤组织的特点：不定形的薄壁组织团块。
光照条件：一般不需要光照
注意：过程中涉及的生命活动只有细胞增殖（有丝分裂），没有细胞分化。
思考：若培养物取自植物的幼茎、叶片等含有叶绿体的部位，愈伤组织中是否会含有叶绿体？为什么？
愈伤组织中不含有叶绿体；
培养物经过诱导后，失去其特有的结构和功能而转变成未分化细胞，因此，愈伤组织中不含有叶绿体。
2.植物组织培养:
一、植物组织培养技术
（4）过程:
外植体
脱分化
愈伤组织
再分化
根、芽
幼苗
完整植株
移栽成活
接种
外植体
诱导愈伤组织
诱导生芽
诱导生根
移栽成活
再分化：愈伤组织能重新分化成芽、根等器官的过程。
实质：基因的选择性表达。
结果：再分化成胚状体，长出芽和根，进而发育成完整的植株。
光照条件：需要给予适当时间和强度的光照
为什么？诱导叶绿素的合成，使试管苗能够进行光合作用。
注意：过程中涉及的生命活动：既有细胞增殖（有丝分裂），又有细胞分化。
根、芽
植物体
脱分化
再分化
适宜的培养条件：
①无菌条件
②种类和比例适宜的营养物质
③适宜环境条件（温度、PH、光等）
④植物激素的诱导和调节：
细胞分裂素 生长素
如：胡萝卜的形成层、菊花幼茎段、月季的花药…
植物组织培养技术--过程
遮光
一定的光照
芽发育成叶，叶肉细胞中叶绿素的合成需要光照。
排列不规则，高度液泡化，呈不定型状态的薄壁细胞。
愈伤组织
离体的植物器官、组织或细胞（外植体）
愈伤组织重新分化为芽、根等器官。
失去特有结构和功能转变成未分化的细胞。
探究·实践·菊花的组织培养
（1）植物细胞一般具有全能性。
（2）在一定的激素和营养等条件的诱导下，已经分化的细胞可以经过脱分化和再分化，形成胚状体，长出芽和根，进而发育成完整的植株。（3）植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素，它们的浓度、比例等都会影响植物细胞的发育方向。
生长素用量与细胞分裂素用来的比值 结果
比值高
比值低
比值适中
有利于根的分化，抑制芽的形成
有利于芽的分化，抑制根的形成
促进愈伤组织的形成
1.实验原理：
（1）外植体：幼嫩的菊花茎段。
（2）体积分数为70%的酒精：对手、超净工作台、外植体进行消毒。
（3）质量分数为5%左右的次氯酸钠溶液：对外植体进行消毒。
（4）无菌水：清洗外植体。
（5）培养基：包括无机营养成分（水和无机盐）、有机营养成分（蔗糖、氨基酸、维生素等）、特定浓度和比例的激素（主要是生长素和细胞分裂素）。蔗糖的作用：提供能量、调节渗透压。灭菌：湿热灭菌法。
经常选择根尖（分生区）、茎的韧皮部（形成层）等分裂能力强、分化程度低的区域作为材料，容易诱导形成愈伤组织。
探究·实践·菊花的组织培养
2.材料分析：
思考：组培过程中较易染菌，因此应在实验前应确定培养基灭菌彻底，如何确定？
将1-3瓶培养基放置于恒温培养箱，预培养3d左右，若无污染，则培养基灭菌彻底，可使用。
*制备好的培养基应尽量在2周内使用，含植物激素的培养基建议在4℃保存；
4.实验步骤
（1）制备外植体
消毒：
酒精
30s
无菌水
2-3次
次氯酸钠溶液
30min
材料：
幼嫩的菊花茎段
2-3次
无菌水洗
消毒与无菌水冲洗
用酒精擦拭双手和超净工作台台面。
探究·实践·菊花的组织培养
4.实验步骤
2）外植体切段
探究·实践·菊花的组织培养
消毒过的外植体置于无菌培养皿
无菌滤纸吸去外植体表面水分
用解剖刀切成0.5~1cm长的小段
超净工作台或接种箱
（3）接种到诱导愈伤组织培养基
在酒精灯火焰旁，将外植体的1/3-1/2插入诱导愈伤组织的培养基中。用封口膜或瓶盖封盖瓶口，并在培养瓶上作好标记。
*接种操作应在酒精灯火焰旁进行，但注意塑料的瓶口不可灼烧；
*接种时，注意外植体的方向，不要倒插（应使形态学下端接触培养基）
4.实验步骤
探究·实践·菊花的组织培养
思考：
1.为什么整个过程要保证无菌操作？
2.为什么外植体不能倒插？（了解）
避免杂菌在培养基上迅速生长消耗营养，同时防止有些杂菌危害培养物的生长。
与生长素的极性运输有关；
生长素含量多的部分容易生出不定根，含量少的部分生出不定芽，一般而言，容易长不定芽的是形态学上端，容易长不定根的是形态学下端，因此应该将形态学上端朝上，下端朝下，若倒插，外植体不易存活。
探究·实践·菊花的组织培养
（4）诱导脱分化
4.实验步骤
探究·实践·菊花的组织培养
不需要光
有光时，往往容易形成维管组织，而不易形成愈伤组织。
愈伤组织培养
将接种了外植体的锥形瓶或植物组织培养瓶置于18-22℃的培养箱中培养。在培养过程中，定期观察和记录愈伤组织的生长情况。
（5）诱导再分化
*注意顺序，先诱导生芽，再诱导生根；
*该过程每日需要给予适当时间和强度的光照；
培养15-20d后，将生长良好的愈伤组织转接到诱导生芽的培养基上。
长出芽后
将其转接到诱导生根的培养基上，进一步诱导形成试管苗。
若先生根后面就不易生芽。
4.实验步骤
探究·实践·菊花的组织培养
（6）移栽培养
4.实验步骤
探究·实践·菊花的组织培养
打开封口膜或瓶盖,让试管苗在培养箱内生长几日。
流水清洗掉根部的培养基后，将幼苗移植到消毒的蛭石或珍珠岩等环境中，待其长壮后再移栽入土。
待其长壮后再移栽入土。每天观察并记录幼苗的生长情况，适时浇水、施肥，直至开花。
幼 苗
愈伤组织
脱分化
CTK/IAA比例适合
再分化
CTK/IAA比例先增大在减小
植物组织培养过程示意图
完整植株
外植体
（1）接种3～4d后，检查外植体的生长情况，统计有多少外植体被污染，有多少能正常生长，试分析它们被污染的原因。
（2）你培养出愈伤组织了吗？如果培养出来了，从刚接种的外植体到长出愈伤组织经历了多少天？这些愈伤组织进一步分化出芽和根了吗？
用于植物组织培养的培养基同样适合某些微生物的生长，如一些细菌、真菌等的生长。培养物一旦受到微生物的污染，就会导致实验前功尽弃，因此要进行严格的无菌操作。导致外植体被污染的原因可能有：培养基、接种工具灭菌不彻底；外植体消毒不彻底；操作过程不符合无菌操作要求等。
观察实验结果，看看是否培养出了愈伤组织，记录多长时间长出了愈伤组织。从刚接种的外植体到长出愈伤组织一般需要2周左右的时间。统计更换培养基后愈伤组织进一步分化成芽和根的比例和时间。
5.结果分析与评价
探究·实践·菊花的组织培养
（3）观察外植体的分化情况，填好结果记录表，并及时分析结果。
（4）你培育的幼苗移栽到露地后，能够正常生长吗？
做好统计和对照，填好结果记录表，培养严谨的科学态度。从实验的第一步开始就要做好实验记录，可以分组配制不同的培养基，如诱导愈伤组织的培养基、诱导生芽的培养基等，还可以进行不同配方的比较。
生根苗移栽技术的关键是既要充分清洗根系表面的培养基，又不能伤及根系。一般使用无土栽培的办法。培养基质要提前消毒，可以向培养基质喷酒质量分数为5%的高锰酸钾，并用塑料薄膜覆盖12h。掀开塑料薄膜24h后才能移栽。新移栽的组培苗要在温室过渡几天，待其长壮后再移植到大田或盆中。可以在课后统计移栽的成活率，看看移栽是否合格。
5.结果分析与评价
探究·实践·菊花的组织培养
4.适宜浓度和比例的激素
①对操作环境、双手、外植体进行消毒；
②对培养基和器械进行灭菌；
③接种操作必须在酒精灯火焰旁进行；
①温度（例如菊花植物组织培养应为18-22℃）；
②光照（例如脱分化需避光，再分化需照光）；
植物激素的种类和含量不同，对愈伤组织的形成和分化的影响不同
*配制合适的培养基，包括有机营养成分、无机营养成分、适宜浓度和比例的激素。
*若细胞不离体，细胞中的基因会选择性地表达，从而形成生物体的不同组织和器官，不能表现出全能性。
能否从以上内容中概括植物组织培养中细胞表现出全能性所需要的条件？
1.离体（最关键）
2.严格的无菌条件
3.适宜的培养条件
5.一定的营养条件
①空白对照：不加任何激素；
②实验组1：生长素用量与细胞分裂素用量的比值为1；
③实验组2：生长素用量与细胞分裂素用量的比值大于1；
④实验组3：生长素用量与细胞分裂素用量的比值小于1。
进一步探究：若想探究生长素与细胞分裂素的使用比例对植物组织培养的影响，则应如何设计对照实验？
探究·实践·菊花的组织培养
特殊的植物组织培养——花药离体培养
花药离体培养
配子
DDTT
DDtt
ddTT
ddtt
正常植株（纯合）
秋水仙素诱导
高杆抗病
DdTt
DT
Dt
dT
dt
单倍体植株
DT
Dt
dT
dt
需要的纯合矮抗品种
该过程涉及的生殖方式是有性生殖，经秋水仙素加倍之后，获得的植株一般为纯合子。
原理
基础概括
过程
植物组织培养
植物细胞的全能性
概念
细胞具有全能性的原因
不离体的细胞不表现全能性的原因
概念
生殖方式
分裂方式
脱分化
再分化
实质
结果
光照条件
生命活动
实质
结果
光照条件
生命活动
实例
菊花的组织培养
步骤
消毒
外植体切段
接种
脱分化
再分化
移栽培养
1.铁皮石斛是一种名贵中药，野生资源十分稀少，其繁殖主要通过植物组织培养实现。下列有关叙述错误的是（ ）
A.用植物组织培养的方法繁殖药材表明在一定条件下，细胞分化是可以逆转的
B.植物细胞的全能性得以表达需要离开母体
C.新植株的形成是细胞分裂和分化的结果
D.高度分化的植物细胞不具有全能性
D
课堂练习
2.下列关于植物组织培养的叙述中，错误的是（ ）
A.培养基中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压
B.培养基中的生长素和细胞分裂素影响愈伤组织的生长和分化
C.离体器官或组织的细胞都必须通过脱分化才能形成愈伤组织
D.同一株绿色开花植物不同部位的细胞经培养获得的愈伤组织基因一定相同
课堂练习
D

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