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第二章 细胞工程
第2节 动物细胞培养（第一课时）
学习目标 核心素养
1.阐明动物细胞培养是从动物体获得相关组织、分散成单个细胞后，在适宜的培养条件下让细胞生长和增殖的过程。动物细胞培养是动物细胞工程的基础。 2．简述干细胞在生物医学工程中有广泛的应用价值。 1.科学思维：说明动物细胞培养的条件和动物细胞培养过程中细胞生长的特点；比较动物细胞培养与植物组织培养的不同。
2．社会责任：说明干细胞在医学、药物安全性与有效性检测等领域的应用及存在的问题。
动物细胞工程（含胚胎工程）的发展历程
1907年，哈里森用一滴淋巴液成功培养了蝌蚪的神经元，首创了动物组织体外培养法.
1951年，张明觉等发现了哺乳动物精子的获能现象.
2014年，世界上第一个用单细胞基因组测序进行遗传病筛查的试管婴儿在我国诞生.
2006年，山中伸弥等获得了诱导多能干细胞，我国科学家用这种细胞培育出了小鼠.
1975年，米尔斯坦和科勒等创立了单克隆抗体技术.
1959年，试管家兔诞生，之后，多种试管动物相继出生.
1958年，格登用非洲爪蟾进行体细胞核移植实验，成功培育出性成熟个体，同一时期，我国科学家童第周等开展了鱼类细胞核移植工作.
1996年,世界上第一只体细胞克隆羊多莉在英国诞生，随后多种克隆动物相继问世.
2017年，我国科学家首次培育了体细胞克隆猴.
1978年，小鼠的桑椹胚被成功分割，次年，科学家分割绵羊胚胎获得了同卵羔羊.
1981年，埃文斯等成功分离和培养了小鼠的胚胎干细胞.
1890年，希普将安哥拉兔的胚胎移入比利时兔的输卵管内，得到了两只安哥拉兔，这是世界上胚胎移植成功的首例.
怎样才能获得大量的自体健康皮肤？
从社会中来
在治疗大面积烧伤时，通常采用的方法是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植。但对这样的病人来说，自体健康皮肤非常有限，使用他人皮肤来源又不足，而且会产生免疫排斥反应。
通过细胞培养构建的人造皮肤
动物细胞培养
动物细胞核移植
动物细胞融合
其它动物细胞工程的基础
生产单克隆抗体
动物
细胞
工程
常用
技术
为什么要进行动物细胞培养？
什么是动物细胞培养？
怎样进行动物细胞的培养？
羽毛中提取细胞
人造肉
一、动物细胞培养
原理：细胞增殖（有丝分裂）。
动物细胞培养概念:从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。
目的：获得细胞或细胞产物；不能获得完整动物个体。
动物细胞培养需要什么样的条件？
（一）动物细胞培养的条件
1.营养（1）成分①已知成分:将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制的培养基。称为合成培养基。
②未知成分：使用合成培养基时，通常需加入血清等一些天然成分。血清中含有人类尚未全部研究清楚、细胞生长和增殖所必需的物质。
（2）培养基的物理性质：培养动物细胞一般使用液体培养基，也称为培养液。
*这里的糖类不包括淀粉、蔗糖等
动物细胞培养所需的基本条件
其他条件
营养条件
糖类、氨基酸、无机盐、维生素等
无菌、无毒的环境
适宜的温度、pH和渗透压
适宜的气体环境
一、动物细胞培养
1、血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等，
2、氨基酸有多种，是细胞合成蛋白质的基本成分，其中有些氨基酸动物细胞本身不能合成（称为必需氨基酸），必须由培养液提供。
3、血清激素有胰岛素、生长激素等及多种生长因子；血清还含有多种未知的促细胞生长因子、 促贴附因子及其他活性物质，能促进细胞的生长、增殖和贴附。
4、因此，细胞培养时，要保证细胞能够顺利生长和增殖，一般需添加10%～20%的血清。
补充资料：
2.无菌、无毒的环境
（1）保证无菌、无毒环境的具体措施
①对培养液和所有培养用具进行灭菌处理。
②在无菌环境下进行操作。
③培养液需要定期更换，以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。
思考题：如何防止培养过程中的微生物污染？
在细胞培养液中添加一定量的抗生素
（一）动物细胞培养的条件
动物细胞培养所需的基本条件
其他条件
营养条件
糖类、氨基酸、无机盐、维生素等
无菌、无毒的环境
适宜的温度、pH和渗透压
适宜的气体环境
一、动物细胞培养
3.适宜的温度、pH和渗透压
（1）适宜的温度：哺乳动物细胞培养的温度多以36.5±0.5℃为宜。
（2）适宜的pH：多数动物细胞生存的适宜pH为7.2-7.4。
（3）适宜的渗透压：维持细胞正常的形态和功能。
（一）动物细胞培养的条件
动物细胞培养所需的基本条件
其他条件
营养条件
糖类、氨基酸、无机盐、维生素等
无菌、无毒的环境
适宜的温度、pH和渗透压
适宜的气体环境
一、动物细胞培养
4.适宜的气体环境
通常采用培养皿或松盖培养瓶。并将它们置于含有95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中进行培养。
O2：细胞代谢所必需的。
CO2：主要作用是维持培养液的pH。
（一）动物细胞培养的条件
动物细胞培养所需的基本条件
其他条件
营养条件
糖类、氨基酸、无机盐、维生素等
无菌、无毒的环境
适宜的温度、pH和渗透压
适宜的气体环境
一、动物细胞培养
阅读教材44-45页，尝试回答以下问题
1、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料
2、为什么将取出的组织分散成单个细胞？
3、如何将组织分散成单个细胞？
4、细胞培养用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是什么成分？用胃蛋白酶可以吗？
5、胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？为什么？
6、动物细胞生长特性：
7、原代培养、传代培养
8、10代以内的细胞的遗传物质有何特点？10代以后的？
传代培养
取动物组织
制成细胞悬液
原代培养
放入CO2培养箱中培养
放入CO2培养箱中培养
用机械的方法，或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理的方法，将组织分散成单个细胞
（二）动物细胞培养的过程
一、动物细胞培养
1.取动物组织：
细胞贴壁
接触抑制
原代培养
传代培养
一般取材于动物胚胎或幼龄动物的组织、器官。
因为这些细胞分化程度低，增殖能力强，容易培养。
（二）动物细胞培养的过程
一、动物细胞培养
细胞贴壁
接触抑制
原代培养
传代培养
（二）动物细胞培养的过程
一、动物细胞培养
2.制成细胞悬液：
（1）将细胞分散成单个细胞。方法：①机械的方法。
②用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理一段时间。
（2）用培养液将细胞制成细胞悬液。
原因：①从动物体取出的成块组织中，细胞与细胞靠在一起，彼此限制了生长和增殖；
②能使细胞与培养液充分接触，更易进行物质交换。
进行动物细胞培养时常用胰蛋白酶分散细胞，这说明细胞间的物质主要是什么成分？用胃蛋白酶行吗？
用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是蛋白质。胃蛋白酶作用的适宜pH约为2,当pH大于6时，胃蛋白酶就会失去活性。多数动物细胞培养的适宜pH为7.2～7.4，胃蛋白酶在此环境中没有活性，所以用胃蛋白酶不行。
酶解法较温和，一定不会对动物细胞造成损伤，对吗？
不对；
使用胰蛋白酶时，要控制好作用时间，因为胰蛋白酶不仅能分解细胞间的蛋白质，长时间作用还会分解细胞膜蛋白等，对细胞造成损伤。
细胞贴壁
接触抑制
原代培养
传代培养
（二）动物细胞培养的过程
一、动物细胞培养
3.进行原代培养
（1）操作过程：将细胞悬液放入培养皿或培养瓶内，置于适宜环境中培养。原代培养：通常将分瓶之前的细胞培养，即动物组织经处理后的初次培养称为原代培养。
（2）体外培养的动物细胞类型
①悬浮生长类：能够悬浮在培养液中生长增殖。
②贴壁生长类：需要贴附于某些基质表面才能生长增殖（细胞贴壁），大多数细胞属于此类。
细胞悬液
放入培养瓶
在适宜条件
在适宜条件
分瓶培养
原代培养
传代培养
为什么要进行分瓶培养？
悬浮生长
贴壁生长
会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏
接触抑制
分瓶培养
(传代培养)
解决
原因
原代培养
问题
细胞分裂受阻
细胞贴壁:悬液中分散的细胞贴附在瓶壁生长的现象。
接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增殖。
思考：“细胞增殖到互相接触的时候，糖蛋白识别了这种信息，就会使细胞停止继续繁殖，出现接触抑制的现象”试结合上述解释，举例说明哪种细胞无接触抑制现象，并阐述原因。
癌细胞；
癌细胞的细胞膜上糖蛋白等物质减少。
细胞贴壁
接触抑制
原代培养
传代培养
（二）动物细胞培养的过程
一、动物细胞培养
4.分瓶、进行传代培养
（2）分瓶的具体做法
悬浮细胞
贴壁细胞
离心法收集
胰蛋白酶处理
制成细胞悬液
分瓶培养
（1）将分瓶后的细胞培养称为传代培养。
离心的作用？
在沉淀中得到细胞，同时去掉上清液中的胰蛋白酶。
思考：正常细胞能否一直传代培养下去？
不可以；
细胞的传代培养一般传至10代后就不易传下去，这时细胞能保持细胞正常的二倍体核型；
传至10-50代左右时，增殖会逐渐缓慢，以至于完全停止，这时部分细胞的细胞核型可能会发生变化，这一阶段的细胞称为细胞株；
继续传代培养时，少部分细胞会克服细胞寿命的自然极限，获得不死性，这些细胞已经发生了突变，正在朝着等同于癌细胞的方向发展，这一阶段的细胞称为细胞系，细胞系的遗传物质一定改变了；
动
物
细
胞
培
养
过
程
动物胚胎或幼龄动物的组织、器官
单个细胞
细胞 悬浮液
10代
细胞
少部分突破细胞寿限“癌变”，无限传代
动物细胞培养不能最终培养成动物体
50代细胞
原代培养
传代培养
细胞贴壁
剥离、分瓶
细胞
分化程度低，增殖能力强
去掉组织间蛋白
加培养液
胰蛋白酶
剪碎
出现接触抑制
(分离组织)
(分散组织)
思考·讨论·有关动物细胞培养的问题
1.幼龄动物的细胞与老龄动物的细胞比较，分化程度低的细胞与分化程度高的细胞比较，哪些细胞更易于培养？为什么？
细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物的细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物的细胞则相反。所以，一般来说，幼龄动物的细胞比老龄动物的细胞易于培养。同样，分化程度越低的细胞，增殖能力越强，所以更容易培养。
植物组织培养 动物细胞培养
原理
培养前处理
取材
培养基的物理性质
培养基的成分
特有成分
植物细胞的全能性
细胞增殖
离体
用机械法或胰蛋白酶、胶原蛋白酶将组织细胞分散开。
离体植物器官、组织、细胞
动物胚胎或幼龄动物的组织、器官
固体
液体(又称培养液)
有机营养成分；无机营养成分；植物激素。
糖类、氨基酸、无机盐、维生素等营养物质及一些天然成分如血清。
植物激素
血清
思考·讨论·有关动物细胞培养的问题
2.动物细胞培养和植物组织培养的比较
植物组织培养 动物细胞培养
特殊环境条件
结果
是否体现细胞的全能性
过程
相同点 再分化需光
气体环境
一般获得新的植株
获得大量细胞
是
否
①培养过程中细胞都进行有丝分裂，不涉及减数分裂；
②均需无菌操作，需要适宜的温度、pH等条件。
思考·讨论·有关动物细胞培养的问题
2.动物细胞培养和植物组织培养的比较
2.干细胞分布：存在于早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中。
1.干细胞概念：机体中能进行自我更新（产生与自身相同的子代细胞）并具有多向分化潜能（分化形成不同细胞类型）的一类细胞称为干细胞。
电镜下的胚胎干细胞
（三）干细胞培养及其应用
一、动物细胞培养
（1）胚胎干细胞（简称ES细胞）：也叫全能干细胞。
①分布：存在于早期胚胎中，
②特点：具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。
③应用实例：ES细胞在体外分化成心肌细胞、神经元细胞和造血干细胞等。
（三）干细胞培养及其应用
一、动物细胞培养
3.干细胞分类：包括胚胎干细胞和成体干细胞等。
（2）成体干细胞：
①分布：存在于成体组织或器官内中，
②常见类别：包括骨髓中的造血干细胞（多能干细胞）、神经系统中的神经干细胞和睾丸中的精原干细胞（专能干细胞）等。
③特点：一般认为，成体干细胞具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力。
④发现最早、研究最多的、应用最成熟的实例：造血干细胞，主要存在于成体的骨髓、外周血和脐带血中。
（三）干细胞培养及其应用
一、动物细胞培养
3.干细胞分类：包括胚胎干细胞和成体干细胞等。
思考：干细胞可以治疗某些顽症的原理是什么？
干细胞可以被诱导分化形成新的组织细胞，经移植可使坏死或退化部位得以修复并恢复正常功能。
胚胎干细胞的局限性：胚胎干细胞必须从胚胎中获取 ，涉及伦理问题；
（三）干细胞培养及其应用
一、动物细胞培养
①概念：通过体外诱导小鼠成纤维细胞，获得了类似胚胎干细胞的一种细胞，称为诱导多能干细胞，简称iPS细胞。
（3）诱导多能干细胞（iPS细胞）
②诱导多能干细胞优点：
a.诱导过程无须破坏胚胎；
b.iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应。
（三）干细胞培养及其应用
一、动物细胞培养
3.干细胞分类：包括胚胎干细胞和成体干细胞等。
③诱导性多潜能干细胞的制备
取出
病人
移植
转入相关因子，细胞发生转化
成纤维细胞
iPS细胞
分化
各种类型的细胞
（三）干细胞培养及其应用
一、动物细胞培养
有着自我更新能力及分化潜能的干细胞，与组织、器官的发育、再生和修复等密切相关。
类型 应用
造血干细胞
神经干细胞
诱导多能干细胞（iPS细胞）
治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病
治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）
可治疗小鼠的镰状细胞贫血症，在治疗阿尔兹海默病、心血管疾病、白血病、帕金森病等领域的研究也取得了新进展
（三）干细胞培养及其应用
一、动物细胞培养
④制备iPS细胞的其他方法
借助载体将特定基因导入细胞中诱导形成iPS细胞
直接将特定蛋白导入受体细胞中诱导形成iPS细胞
用小分子化合物来诱导形成iPS细胞诱导形成iPS细胞
成纤维细胞以及已分化的T细胞、B细胞
*因此，普遍认为iPS细胞的应用前景优于胚胎干细胞。
干细胞应用面临的问题:存在导致肿瘤发生的风险。
（三）干细胞培养及其应用
一、动物细胞培养
iPS细胞的来源：
（3）诱导多能干细胞（iPS细胞）
概述
培养条件
过程
动物细胞培养
取材
原代培养
营养条件
温度、pH和渗透压
无菌、无毒的环境
气体环境
制成细胞悬液
传代培养
干细胞
分布
分类
应用
小结：
1.下列属于动物细胞培养与植物组织培养区别 (　　)
A.动物细胞培养所用的培养基的成分与植物的不同
B.动物细胞培养不需要在无菌条件下进行
C.动物细胞培养过程中可发生基因重组，而植物组织培养不能
D.植物组织培养和动物细胞培养都体现了细胞的全能性
2.在将动物组织块分散成单个细胞时，可以使用胰蛋白酶。由此不能推测出来的是 (　　)
A.动物细胞之间可能依靠蛋白质相互联系
B.胰蛋白酶可能会对动物细胞造成损伤
C.处理时一定要注意处理时间、加酶量
D.换用胃蛋白酶也能起到相同的作用
A
课堂练习
D
3.某医院接生了一名婴儿，医院为他保留了脐带血，若后来他患了胰岛素依赖型糖尿病，就可以通过脐带血中的干细胞为其治疗。关于这个实例说法正确的 ( 　　)
A.用干细胞培育出人体需要的器官来治疗疾病，需要激发细胞的所有全能性
B.用脐带血干细胞能治疗这个孩子的所有疾病
C.如果要移植用他的干细胞培育出的器官，需要用到细胞培养技术
D.如果要移植用他的干细胞培养出的器官，应该长期给他使用免疫抑制药物
C
课堂练习
4.右图为动物细胞培养过程示意图，请回答以下几个问题：
（1）容器A中的动物器官或组织首先要剪碎，然后用胰蛋白酶处理，其目的是______________________。
（2）培养先在B瓶中进行。瓶中的培养基成分有葡
萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和_________等。当
细胞分裂生长到_________时，就会停止增殖，需用
胰蛋白酶处理后分瓶继续培养，称为_________。
（3）有一类不正常的动物细胞，体外培养不受接触
抑制机制的制约而表现为“疯长”这类细胞最可能是
_______。
使组织分散成单个细胞
动物血清
相互接触
传代培养
癌细胞
课堂练习
1.如果想将iPS细胞用于紧急情况，应该提前采取什么措施？
建立iPS细胞库（HLA多态性丰富的iPS细胞库），可以为需要的人找到HLA匹配度较高的iPS细胞
可以用来治疗不孕症；
可以用来进行濒危物种的克隆；
可以对获得的生殖细胞进行转基因操作，再经过受精、胚胎发育等过程来获得转基因动物；
可能会带来一系列的伦理问题，例如用同一个人的iPS细胞分别诱导形成精子和卵子，两者受精可能培育出“单亲”婴儿，有的人还可能有目的地选择iPS细胞，从而”设计”婴儿。
拓展应用：
2.如果诱导iPS细胞定向分化为生殖细胞的技术发展成熟，该技术可能会有哪些应用？又可能带来哪些问题？

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