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(共46张PPT)
“生物导弹”追踪癌细胞
抗体
第二章 细胞工程
第2节 动物细胞工程
二 动物细胞融合技术与单克隆抗体
学习目标 核心素养
1.阐明动物细胞融合是指通过物理、化学或生物学等手段，使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。 2．概述细胞融合技术是单克隆抗体制备的重要技术。 1.生命观念：以细胞结构与功能为基础，理解动物细胞融合的内涵。
2．科学思维：结合具体实例，以流程图的形式表示单克隆抗体的制备过程。
3．社会责任：说明单克隆抗体的特点及应用。
植物体细胞杂交
植物细胞融合
植物组织培养
植物体细胞杂交技术可以跨越不同种植物之间生殖隔离的屏障，培育出新的作物类型。那么，有没有技术让不同种动物的体细胞进行杂交，培育出集不同细胞的优势于一身的动物细胞呢？　　　　　
温故而知新：
实例1：自然条件
受精作用
1970年人工条件下的人-鼠细胞融合实验
实例2：人工诱导
二、动物细胞融合技术
请同学们快速阅读课本P48页回答以下问题
1. 什么是动物细胞融合技术（概念）？原理是什么？
2. 所形成的杂种细胞有什么特点？
3. 诱导动物细胞融合的方法有哪些？
4. 动物细胞融合技术的意义和应用有哪些？
1.概念：使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。融合后形成的杂交细胞具有原来两个或多个细胞的遗传信息。
3.原理：细胞膜具有一定的流动性。
2.结果：
形成的杂交细胞具有原来两个或多个细胞遗传信息的。
二、动物细胞融合技术
4.诱导方法：
物理法：
化学法：
生物法：
灭活的病毒 如：仙台病毒
电融合法
聚乙二醇（PEG)
*其中灭活病毒诱导法是动物细胞融合特有的诱导融合方法
二、动物细胞融合技术
仙台病毒
紫外线
灭活
丧失感染活性（不感染细胞）
保留融合活性（诱导细胞融合）
思考.“灭活病毒”中灭活的具体含义是什么？
用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构。
病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
思考.灭活病毒诱导细胞融合的原理是什么？
用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程：
灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面
↓
细胞膜被病毒颗粒穿通
↓
细胞膜连接
↓
细胞核融合，形成杂交细胞
正在融合的
淋巴细胞与骨髓瘤细胞
正在融合的鸡血细胞
19世纪30年代，科学家曾在患肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中观察到多核细胞。如何解释这一现象？
肺结核病人病理切片
病人体内病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。
灭活病毒诱导法
5.融合实质及完成的标志：细胞核的融合
二、动物细胞融合技术
已成功的动物细胞融合实例有很多，如鼠—鸡、鼠—兔、鼠—猴、人—鼠、人—兔、人—鸡、人—蛙等上百种融合细胞。甚至已成功完成了酵母菌—鸡 、人—胡萝卜 等细胞的融合。
生物种间杂交想像图
（1）突破有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。
（2）研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。
（3）利用动物细胞融合技术而
发展起来的杂交瘤技术，
为制造单克隆抗体开辟了
新途径。
种间、属间、科间，甚至动物和植物之间的细胞融合都已获得成功。
6.意义：
二、动物细胞融合技术
植物体细胞杂交 动物细胞融合
原理
细胞融合前的处理方法
诱导细胞融合的方法
细胞融合成功的标志
主要用途
意义
细胞膜具有一定的流动性、植物细胞的全能性
细胞膜具有一定的流动性
用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁
用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞
聚乙二醇（PEG）融合法、电融合法、离心法；高Ca2+-高pH融合法
聚乙二醇（PEG）融合法、电融合法、
灭活病毒诱导法
再生出细胞壁
细胞核的融合
获得完整的杂种植株
主要用于制造单克隆抗体
打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种
突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能
总结：比较植物体细胞杂交和动物细胞融合
处理方法
诱导手段
结果
原理
看图对比动物和植物细胞融合的异同
抗原 动物体内
刺激
浆细胞
抗体
抗原不纯
抗体不纯
筛选单一B细胞
不能无限增殖产生大量抗体
传统抗体制备方法：向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物血清中分离所需抗体。
缺陷： 产量低、纯度低，
且抗体的特异性差、灵敏度低。
如何解决这个问题呢？
阅读P49并思考：
科学家发现B淋巴细胞有什么特点？ 怎样才能获得大量的单一抗体？
体外培养时，一个B淋巴细胞不能无限增殖
我们所学的哪种细胞是可以无限增殖的？
有什么方法能使B细胞产生抗体的能力和无限增殖能力同时具备？
科学家发现：１.体内产生的特异性抗体种类多达百万种以上
　　　　　　　２.每个B细胞只分泌一种特异性的抗体
单
克 隆
抗 体
克隆
一个
B淋巴细胞
细胞群
抗体
遗憾：
癌细胞
动物细胞融合
一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体
骨髓瘤细胞（癌细胞）能无限增殖
动物细胞融合
动物细胞培养
单克隆抗体
杂交瘤细胞
阅读课本P49-50,了解单克隆抗体的制备过程
一个大胆的猜想
1975年英国科学家米尔斯坦和柯勒发明了单克隆抗体的制备技术，于1984年获得了诺贝尔生理学或医学奖。
由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。
1、单克隆抗体：
三、单克隆抗体及其应用
单
克 隆
抗 体
克隆
一个
B淋巴细胞
细胞群
抗体
多种杂交细胞
注射特定的抗原
多种B淋巴细胞
培养骨髓瘤细胞
骨髓瘤细胞
诱导融合
将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合
2.米尔斯坦和科勒制备单克隆抗体过程示意图
三、单克隆抗体及其应用
杂交瘤细胞(既能迅速大量增殖，又能产生抗体)
体外培养
注射到小鼠腹腔内
单克隆抗体
选择培养基筛选获得
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞(分泌的抗体能与特定抗原结合)
多次筛选
从细胞培养液或小鼠腹水中获取大量的单克隆抗体。
2.米尔斯坦和科勒制备单克隆抗体过程示意图
三、单克隆抗体及其应用
诱导融合
选择培养基
抗原抗体杂交法
体外培养或小鼠腹腔内增殖
动物细胞融合
动物细胞培养
给小鼠注射特定的抗原蛋白
B淋巴细胞（免疫）
骨髓瘤细胞
未融合细胞
多种融合细胞
多种杂交瘤细胞
单克隆抗体
能分泌所需抗体
的杂交瘤细胞
第一次筛选
第二次筛选
3.单克隆抗体过程
三、单克隆抗体及其应用
培养骨髓瘤细胞
诱导融合
选择培养基
抗原抗体杂交法
体外培养或小鼠腹腔内增殖
动物细胞融合
动物细胞培养
给小鼠注射特定的抗原蛋白
B淋巴细胞（免疫）
骨髓瘤细胞
未融合细胞
多种融合细胞
多种杂交瘤细胞
单克隆抗体
能分泌所需抗体
的杂交瘤细胞
第一次筛选
第二次筛选
3.单克隆抗体过程
三、单克隆抗体及其应用
培养骨髓瘤细胞
（1）该过程中应用到的技术
动物细胞融合、动物细胞培养
（2）原理：
（3）注射特定抗原的目的
细胞膜具有一定的流动性、细胞增殖
用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞。
*不是为了得到抗体！
诱导融合
选择培养基
抗原抗体杂交法
体外培养或小鼠腹腔内增殖
动物细胞融合
动物细胞培养
给小鼠注射特定的抗原蛋白
B淋巴细胞（免疫）
骨髓瘤细胞
未融合细胞
多种融合细胞
多种杂交瘤细胞
单克隆抗体
能分泌所需抗体
的杂交瘤细胞
第一次筛选
第二次筛选
3.单克隆抗体过程
三、单克隆抗体及其应用
培养骨髓瘤细胞
（4）诱导融合的方法：
PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法
动物细胞特有的为：
灭活病毒诱导法
思考：只考虑两两融合，诱导融合之后，一定会得到所需的杂交瘤细胞吗？
未融合的亲本细胞
两两融合的细胞
融合的具有同种核的细胞
融合的杂交瘤细胞
B-B细胞
瘤-瘤细胞
诱导融合
选择培养基
抗原抗体杂交法
体外培养或小鼠腹腔内增殖
动物细胞融合
动物细胞培养
给小鼠注射特定的抗原蛋白
B淋巴细胞（免疫）
骨髓瘤细胞
未融合细胞
多种融合细胞
多种杂交瘤细胞
单克隆抗体
能分泌所需抗体
的杂交瘤细胞
第一次筛选
第二次筛选
3.单克隆抗体过程
三、单克隆抗体及其应用
培养骨髓瘤细胞
（5）第一次筛选的目的
（6）如何筛选
筛选获得杂交瘤细胞
（7）筛选原理
用特定的选择培养基进行筛选
（8）杂交瘤细胞的特点
在选择培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。
既能迅速大量繁殖，又能产生抗体
补充资料：第一次筛选获得杂交瘤细胞
1.细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基喋呤阻断。
2.人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但不能分裂增殖。
3.鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径，但能不断分裂增殖。
筛选出杂交瘤细胞方法？
培养基中加入氨基嘌呤
细胞无增殖能力的细胞在培养基中存活仅5-7天，细胞的多聚体也容易死去。
将诱导融合后的细胞接种于HAT培养基后两周，则细胞生存状况及原因为：
B细胞和B-B细胞________________________________________
骨髓瘤细胞和瘤-瘤细胞_____________________________________________
杂交瘤细胞________________________________________________
死亡；能进行补救合成途径，但是无增殖能力；
死亡；两种途径均无法进行，无法合成DNA，无法增殖；
存活；能进行补救合成途径，能合成DNA，可大量增殖；
诱导融合
选择培养基
抗原抗体杂交法
体外培养或小鼠腹腔内增殖
动物细胞融合
动物细胞培养
给小鼠注射特定的抗原蛋白
B淋巴细胞（免疫）
骨髓瘤细胞
未融合细胞
多种融合细胞
多种杂交瘤细胞
单克隆抗体
能分泌所需抗体
的杂交瘤细胞
第一次筛选
第二次筛选
3.单克隆抗体过程
三、单克隆抗体及其应用
培养骨髓瘤细胞
思考：得到的杂交瘤细胞一定是所需的吗？
杂交瘤细胞并不纯，因为从脾脏获得的B淋巴细胞不纯（既有未免疫的B淋巴细胞，又有产其他抗体的B淋巴细胞，以及能产所需抗体的B淋巴细胞），因此要进行第二次筛选；
诱导融合
选择培养基
抗原抗体杂交法
体外培养或小鼠腹腔内增殖
动物细胞融合
动物细胞培养
给小鼠注射特定的抗原蛋白
B淋巴细胞（免疫）
骨髓瘤细胞
未融合细胞
多种融合细胞
多种杂交瘤细胞
单克隆抗体
能分泌所需抗体
的杂交瘤细胞
第一次筛选
第二次筛选
3.单克隆抗体过程
三、单克隆抗体及其应用
培养骨髓瘤细胞
（9）第二次筛选的目的
获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。
（10）如何筛选
用96孔板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下，进行克隆化培养和抗体检测（进行多次筛选）
（11）选择抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞，
即分泌的抗体能与特定的抗原结合。
（12）抗体检测原理：抗原和抗体能够特异性结合(分子水平的鉴定）
克隆化培养和抗体检测
★
每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞
有限稀释法
侧面模拟图
克隆化培养一段时间
取上清液进行抗体检测
补充资料：第二次筛选——克隆化培养和抗体检测
第一次筛选 第二次筛选
原因
方法
结果
诱导融合后得到的细胞中，除杂交瘤细胞之外，还有未融合的亲本细胞，也有融合的具有同种核的细胞
由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经第一次筛选之后获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞
用特定的选择培养基进行筛选
用96孔板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下，进行克隆化培养和抗体检测（进行多次筛选）
筛选获得杂交瘤细胞
获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
两次筛选的比较
诱导融合
选择培养基
抗原抗体杂交法
体外培养或小鼠腹腔内增殖
动物细胞融合
动物细胞培养
给小鼠注射特定的抗原蛋白
B淋巴细胞（免疫）
骨髓瘤细胞
未融合细胞
多种融合细胞
多种杂交瘤细胞
单克隆抗体
能分泌所需抗体
的杂交瘤细胞
第一次筛选
第二次筛选
3.单克隆抗体过程
三、单克隆抗体及其应用
培养骨髓瘤细胞
（13）如何获取大量所需杂交瘤细胞
在体外条件下大规模培养（接种于培养液中）或注射到小鼠腹腔内增殖。
（14）如何获取单克隆抗体
①体外培养：从细胞培养液中获取。
②小鼠腹腔内培养：从小鼠腹水中获取。
（15）单克隆抗体的优点：能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备。
诱导其融合的方法有哪些？
注射抗原的目的是什么？
大量增殖杂交瘤细胞获得单抗的方法
两次筛选的目的
获得能产生相应抗体的B淋巴细胞
物理:离心、振动、电激
化学:聚乙二醇
生物：灭活的病毒
第1次筛选得到杂交瘤细胞（多种）。
第2次筛选得到能产生所需抗体的杂交瘤细胞。
体外培养或注射到小鼠腹腔内增殖。
效应B细胞
B淋巴细胞
注射抗原
骨髓瘤细胞
融合
B-B细胞
杂交瘤细胞
瘤-瘤细胞
选择性培养基 筛选1
多种杂交瘤细胞
符合要求的杂交瘤细胞
抗原-抗体
杂交法
筛选2
克隆化
体外培养
小鼠腹腔内增殖
单克隆抗体
总结
效应B细胞
B淋巴细胞
注射抗原
骨髓瘤细胞
融合
B-B细胞
杂交瘤细胞
瘤-瘤细胞
选择性培养基 筛选1
多种杂交瘤细胞
符合要求的杂交瘤细胞
抗原-抗体
杂交法
筛选2
克隆化
体外培养
小鼠腹腔内增殖
单克隆抗体
杂交瘤细胞特点
既可以产生特异性抗体，又可以大量增殖
单克隆抗体制备中包括几个阶段？
动物细胞融合、动物细胞培养
原理
细胞膜的流动性、细胞增殖
单克隆抗体的优点：
特异性强，灵敏度高，可大量制备。
总结
（1）原理：单克隆抗体能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备。
（2）具体应用及部分实例：
①多种疾病的诊断
实例：利用同位素或荧光标记的单克隆抗体在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。
②病原体的鉴定
实例：乙肝病毒表面抗原定量检测试剂盒。
③其他类型诊断
实例：早早孕诊断试剂盒。
4.单克隆抗体的应用
三、单克隆抗体及其应用
不同水平的克隆及实例
（1）分子水平的克隆：如DNA复制、PCR技术。
（2）细胞水平的克隆：如细胞增殖、动物细胞培养。
（3）个体水平的克隆：如植物组织培养、动物细胞核移植。
资料1:用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的“早早孕诊断试剂盒”。在妊娠第8天就可以做出诊断，这比原来的诊断方法提前了10d左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。
思考·讨论·单克隆抗体的应用
作为诊断试剂——最广泛应用
准确、高效、简易、快速
资料2:使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用。抗体-药物偶联物(ADC)，将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。
思考·讨论·单克隆抗体的应用
ADC的作用机制示意图
①
ADC
②
③
④
溶酶体裂解
释放药物
⑤
细胞凋亡
运载药物
（1）具体应用实例
与药物结合，制成抗体-药物偶联物（ADC），杀伤癌细胞；
ADC通常由抗体、接头和药物三部分组成；
（2）原理：通过将药物与能特异性识别肿瘤细胞抗原的单克隆抗体结合，实现对肿瘤细胞的选择性杀伤；
发挥杀伤作用的为放射性同位素、化学药物或细胞毒素；
单克隆抗体作用为靶向运输作用。
（3）优点：靶点清楚、毒副作用小（不会对健康细胞造成伤害）
思考·讨论·单克隆抗体的应用
直接用于治疗疾病
实例：利妥昔单抗（美罗华）是一种针对CD20抗原的人鼠嵌合型单克隆抗体，是第一个被FDA批准用于临床治疗的单抗。进入人体后能通过介导抗体依赖的细胞毒性作用、补体依赖的细胞毒性作用和抗体与CD20分子结合引起的直接效应，抑制细胞生长，改变细胞周期以及凋亡等方式杀死淋巴瘤细胞。
思考·讨论·单克隆抗体的应用
1.ADC的抗体和药物各具有什么作用？
2.除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？
3.单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？
抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞；药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。
可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗。一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗。
单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高；生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用，有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒。ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。
思考·讨论·单克隆抗体的应用
4.单克隆抗体在临床上还有哪些应用？你可以课后搜集资料，然后以“单克隆抗体在临床上的应用”为主题，出一期黑板报或制作电子板报宣传相关知识。
单克隆抗体在临床上的应用涉及治疗、诊断等方面。单克隆抗体药物已被广泛用于肿瘤、自身免疫病等疾病的治疗，如利妥昔单抗被用于治疗复发难治的低分化B细胞淋巴瘤；曲妥珠单抗被用于治疗乳腺癌等。在临床诊断方面，单克隆抗体被广泛用于-些感染性疾病的检测、肿瘤的诊断、激素和细胞因子的测定等。以单克隆抗体在诊断肿瘤方面的应用为例，用放射性同位素或荧光标记抗肿瘤表面抗原的单克隆抗体，可以用这些抗体来对体内的肿瘤进行定位，辅助诊断并确定肿瘤的复发与转移等。
思考·讨论·单克隆抗体的应用
概述
应用
动物细胞融合
技术
过程
结果
意义
原理
融合方法
原理
应用
单克隆抗体的制备
免疫处理
第一次筛选
诱导融合
第二次筛选
大规模培养
诊断试剂
运载药物
治疗疾病
克隆化培养
抗体检测
体外培养
小鼠腹腔
小结：
1.下列关于细胞工程的叙述，错误的是(　 )
A.电融合法可诱导植物原生质体融合或动物细胞融合
B.去除植物细胞的细胞壁和将动物组织分散成单个细胞均需酶处理
C.小鼠骨髓瘤细胞和经抗原免疫的小鼠B淋巴细胞融合可制备单克隆抗体
D.培养人的浆细胞能产生单克隆抗体
2.单克隆抗体制备过程中使用的骨髓瘤细胞是一种缺陷型细胞，在含有次黄嘌呤、氨基嘌呤和胸腺嘧啶的培养基(HAT)中无法生长；而小鼠B淋巴细胞是正常细胞，在HAT培养基上可正常存活。用聚乙二醇诱导细胞融合后，经过数代培养，最终可在HAT培养基上存活的细胞是(　　)
A.骨髓瘤细胞之间形成的融合细胞 B.B淋巴细胞间形成的融合细胞
C.骨髓瘤细胞与B淋巴细胞之间形成的融合细胞 D.B淋巴细胞
D
课堂练习
C
3.科学家将经过羊红细胞免疫过的小鼠B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，产生杂交瘤细胞，并能分泌单克隆抗体。羊红细胞和B淋巴细胞在该实验中分别属于 (　　 )
A.癌细胞和记忆淋巴细胞 B.抗原物和浆细胞
C.特定抗体物和记忆淋巴细胞 D.癌细胞和浆细胞
B
课堂练习
（1）为了得到能产生抗新型冠状病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞，需要进行筛选。图中筛选1的培养基中进行细胞培养的结果是______________________。图中筛选2含多次筛选，筛选所依据的基本原理是_____________________。
（2）单抗特异性比一般抗血清强，原因是一般抗血清中的抗体是__________
_________________________。
（3）若要使能产生抗新型冠状病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞大量增殖，通常采用的方法有____________________________________________________。
4.为研制抗新型冠状病毒的单克隆抗体，某研究性学习小组以兔子甲为实验材料设计了以下实验流程。回答下列问题：
只有杂交瘤细胞能够生存
抗原与抗体特异性反应
一群识别
不同抗原部位的抗体混合物
将杂交瘤细胞体外培养、将杂交瘤细胞注射到兔子腹腔内增殖
课堂练习

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