资源简介

(共35张PPT)
基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
原理：基因重组。
操作水平：分子水平。
操作环境：生物体外。
操作对象：基因。
结果：赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。
基因工程的概念
1944年艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。
1950年埃特曼发明了一种测定氨基酸序列的方法。2年后，桑格首次完成了对胰岛素氨基酸序列的测定。
1958年梅塞尔森和斯塔尔用实验证明了DNA的半保留复制。随后不久，克里克提出中心法则。
1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。
1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。截至1966年，64个密码子均被成功破译。
1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。
1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性内切核酸酶（简称限制酶）。
20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。
1972年，伯格首先在体外进行了DNA改造的研究，成功构建了第一个体外重组DNA分子。
1973年，科学家证明质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，并实现物种间的基因交流。至此，基因工程正式问世。
1977年，桑格等科学家发明了DNA序列分析的方法，为基因序列图的绘制提供了可能。此后，DNA合成仪的问世为体外合成DNA提供了方便。
1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成为世界各国研究和投资开发的热点。
1983年，科学家采用农杆菌转化法培育出世界上第一例转基因烟草。此后，基因工程进入了迅速发展的阶段。
1984年，我国科学家朱作言领导的团队培育出世界上第一条转基因鱼。
1985年，穆里斯等人发明了PCR，为获取目的基因提供了有效手段。
1990年，人类基因组计划启动。2003年，该计划的测序任务顺利完成。
21世纪以来，科学家发明了多种高通量测序技术，可以实现低成本测定大量核酸序列，加速了人们对基因组序列的了解。
2013年，华人科学家张锋及其团队首次报道利用最新的基因组编辑技术——CRISPR（成簇规律间隔短回文重复）技术编辑了哺乳动物基因组。该技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。
第1节 重组DNA技术的基本工具
第三章 基因工程
学习目标 核心素养
1.概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的。 2．阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。 1.科学思维：模拟重组DNA分子的操作过程，说出合成新DNA分子的基本原理。
2．社会责任：关注基因工程的社会议题，参与讨论基础理论和技术发展如何催生基因工程。
从社会中来
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。
那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？
这些“分子工具”各具有什么特征呢？
转基因番木瓜
非转基因番木瓜
“分子手术刀”
准确切割DNA分子
“分子缝合针”
“分子运输车”
将DNA片段连接起来
将体外重组好的DNA分子导入受体细胞
重组DNA技术的基本工具
2.主要来源：
主要是从原核生物中分离纯化出来的。
一、限制性核酸内切酶 ——分子手术刀
1.全称和简称
全称——限制性内切核酸酶
简称——限制酶
3.种类与命名
现在已经从约300种微生物中分离出了约4000种限制性内核酸切酶。
流感嗜血杆菌的d菌株( Haemophilus influenzae d )中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:____________________________
HindⅠ、HindⅡ、 HindⅢ
资料卡：限制酶的命名：用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。例如，一种限制酶是从大肠杆菌( Escherichia coli)的R型菌株分离来的，就用字母EcoR表示；如果它是从大肠杆菌R型菌株中分离出来的第一种限制酶，则进一步表示成EcoRI。
一、限制性核酸内切酶 ——分子手术刀
练习：粘质沙雷氏杆菌（Serratia marcesens）中分离的第一种限制酶即_______
SmaⅠ
一、限制性核酸内切酶 ——分子手术刀
3.特点：能识别双链 DNA 分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
大肠杆菌的EcoRⅠ限制酶只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。
黏性末端
黏性末端
5'
3'
5'
3'
T
A
G
G
T
A
T
C
C
A
磷酸二酯键
4.识别序列：大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
EcoRⅠ
5’…G-A-A-T-T-C…3’
3’…C-T-T-A-A-G…5’
SmaⅠ
5’…C-C-C-G-G-G…3’
3’…G-G-G-C-C-C…5’
BamHⅠ
5’…G-G-A-T-C-C…3’
3’…C-C-T-A-G-G…5’
TaqⅠ
5’……T-C-G-A……3’
3’……A-G-C-T……5’
限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，称为回文序列。
在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。
一、限制性核酸内切酶 ——分子手术刀
5.切割结果
当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端；
当限制酶在它识别序列的中轴线处切开时，产生的是平末端；
一、限制性核酸内切酶 ——分子手术刀
EcoR Ⅰ
中轴线
粘性末端
平末端
Sam Ⅰ
现学现用：写出下列限制酶切割形成的黏性末端
BamHⅠ________ EcoRⅠ________
HindⅢ________ BglⅡ ________
GATC
AATT
AGCT
GATC
*思考：你从中发现什么现象了？
不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端
要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？
要切两个切口，产生四个黏性末端。
如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？
会产生相同的黏性末端
供体生物细胞
取出DNA
限制酶
目的基因
思考：
你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？
原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。
为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？
通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。
Hind III和EcoR I
下列操作中选用哪种限制酶切割来构建重组质粒？
各抒己见
识别双链DNA 分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
主要是原核生物
数千种
1、来源：
2、种类：
3、作用特点：
4、结果：
形成两种末端
小结： “分子手术刀” ——限制酶
黏性末端
平末端
G A A T T C
C T T A A G
G A A T T C
C T T A A G
G
C T T A A
A A T T C
G
G
C T T A A
A A T T C
G
用同种限制酶切割(EcoRⅠ)
把两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？
思考：
G
C T T A A
A A T T C
G
G
C T T A A
A A T T C
G
如何将不同种来源的DNA片段连接起来？
1.作用：将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。
注意：不是连接氢键（氢键的形成不需要酶的催化）。
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
（1）E·coli DNA连接或T4DNA连接酶连接粘性末端
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
（2）T4 DNA连接酶可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，效率低
1.作用：将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。
注意：不是连接氢键（氢键的形成不需要酶的催化）。
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
CTTCATG
GAAGTACTTAA
AATTCCCTAA
GGGATT
GG...TCTTAA
AATTCC...AG
TCTTCATG
AGAAGTACTTAA
AATTCCCTAAG
GGGATTC
GG...TCTTAA
AATTCC...AG
（3） E·coli DNA连接酶在基因工程中的应用
1.作用：将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。
注意：不是连接氢键（氢键的形成不需要酶的催化）。
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
种类 E·coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源
功能特性
相同点 大肠杆菌
T4噬菌体
只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，不能连接具有平末端的DNA片段
既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端，又可以连接双链DNA片段的平末端（但连接平末端的效率相对较低）
恢复的都是磷酸二酯键
（4）E·coli DNA连接酶与T4DNA连接酶比较：
DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？
1.作用：将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。
注意：不是连接氢键（氢键的形成不需要酶的催化）。
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
A A T T G
C
A
A
T
T
A
A
T
T
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶的作用
DNA连接酶 DNA聚合酶
相同点 作用实质 化学本质 不 同 点 模板
作用对象
作用结果
用途
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质
不需要
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
形成DNA的一条链
基因工程
DNA复制
只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
（5）DNA连接酶与DNA聚合酶的比较：
1.作用：将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。
注意：不是连接氢键（氢键的形成不需要酶的催化）。
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
DNA连接酶、DNA聚合酶、限制酶、解旋酶的比较
拓展延伸
名称 作用部位 作用结果
限制酶 磷酸二酯键 将DNA切成两个片段
DNA连接酶 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
DNA(水解)酶 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶 碱基对之间 的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链，
形成两条长链
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
1.作用：将外源基因送入受体细胞&在受体细胞内对目的基因进行大量复制。
2.种类：质粒、噬菌体和动植物病毒等。它们的来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大差别。
最常用的载体——质粒:一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
拟核DNA
质粒
氨苄青霉素抗性基因
目的基因插入位点
复制原点
大肠杆菌及质粒结构模式图
3.作为载体需具备的条件
（1）有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中。
（2）能在细胞中进行自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
（3）常有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选。如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。
在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
氨苄青霉素抗性基因
目的基因插入位点
复制原点
对受体细胞无害
标记基因的筛选原理：载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
普通培养基
不含抗生素
选择培养基50 g/ml四环素
例：选用下图载体将目的基因导入细菌中并将含有目的基因的细菌筛选出来。
（1）在培养细菌的培养基中添加抗生素B，则应该选择的限制酶为_______。
（2）在培养细菌的培养基中添加抗生素A，则应该选择的限制酶为_____。
①或②
①
1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？
剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。
思考·讨论·重组DNA分子
如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对，可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。
不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上。
2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对 如果不能，可能是什么原因造成的？
3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
限制酶
DNA连接酶
载体
①对受体细胞无害；
②有一个至多个限制酶切割位点；
③有特殊的标记基因；
④能自我复制或能整合到宿主DNA上。
质粒、 λ噬菌体衍生物 、动植物病毒
小结
基因工程的基本工具
作为载体的条件
种类:
磷酸二酯键
来源：
主要来源于原核生物
特点：
作用部位：
具有专一性
结果：
形成黏性末端或平末端
连接部位：磷酸二酯键
种类： E.coliDNA连接酶、T4 DNA连接酶
作用：把两条双链DNA片段拼接起来
1.限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，以下说法正确的是( 　)
A.DNA连接酶连接的是两条链碱基对之间的氢键
B.限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸
C.E.coli DNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端
D.限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，所以也能剪切自身的DNA
B
课堂练习
2.图1为某种质粒结构简图，图2表示某外源DNA上的目的基因，小箭头所指分别为限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ、HindⅢ的酶切位点。下列有关叙述错误的是( )
A.在基因工程中若只用一种限制酶
完成对质粒和外源DNA的切割，则可选
EcoRⅠ
B.如果将一个外源DNA分子和一个
质粒分别用 EcoRⅠ酶切后，再用DNA连接酶连接，形成一个含有目的基因的重组DNA，此重组DNA中 EcoRⅠ酶切点有1个
C.为了防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，酶切时可使用BamHⅠ和Hind Ⅲ 两种限制酶同时处理
D.质粒是一种结构很小的、能自主复制的环状DNA，是基因工程中最常用的载体
B
课堂练习

展开更多......

收起↑