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第1节 重组DNA技术的基本工具
第三章 基因工程
学习目标 核心素养
1.概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的。 2．阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。 1.科学思维：模拟重组DNA分子的操作过程，说出合成新DNA分子的基本原理。
2．社会责任：关注基因工程的社会议题，参与讨论基础理论和技术发展如何催生基因工程。
DNA的粗提取与鉴定
探究和实践
探究·实践·DNA的粗提取与鉴定
一、提取生物大分子的基本思路：
选用一定的物理或化学方法，分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。
实验设计思路：DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法去除其他成分，对DNA进行提取。
探究·实践·DNA的粗提取与鉴定
1.提取原理
（1）DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。
（2）DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L NaCl溶液。
0
0.14
NaCI浓度（mol/L）
DNA溶解度
二、提取生物大分子的提取原理与鉴定原理
2.鉴定原理
在一定温度下（沸水浴），DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可以作为鉴定DNA的试剂。
DNA
+
二苯胺
沸水浴
蓝色
探究·实践·DNA的粗提取与鉴定
三、实验材料的选取：
不同生物的组织中DNA含量不同。在选取材料时，应本着DNA含量高、材料易得、便于提取的原则。你认为如下提供的材料中哪些不适合提取DNA？为什么？
供选材料：新鲜洋葱（16）、香蕉、菠菜（12）、菜花、、猕猴桃（58）；猪肝（38）、鱼卵、鸡血（78）、哺乳动物的成熟红细胞；在液体培养基中培养的大肠杆菌（1）（括号内为染色体条数）
原则上，凡是含有DNA的生物材料都可以考虑;
选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。
(1)研磨液:含有NaCl、EDTA、SDS、Tris和HCl
(2)体积分数为95%的酒精:析出DNA
(3)2mol/L 的NaCl溶液:溶解DNA
(4)二苯胺试剂:鉴定DNA，要现配现用
(5)蒸馏水
探究·实践·DNA的粗提取与鉴定
试剂
探究·实践·DNA的粗提取与鉴定
四、方法步骤：
1.取材、研磨:称取30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL 研磨液，充分研磨。
(1)研磨的目的
破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中
(2)研磨时间不宜太长
防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量
(3)有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶
研磨效果好（有利于充分研磨）
(4)研磨不宜太用力
探究·实践·DNA的粗提取与鉴定
2.过滤或离心取上清液：在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。也可直接将研磨液倒入塑料离心管中，1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。
①上清液中除DNA之外，可能含有哪些杂质？
可能含有核蛋白、多糖等杂质
②低温放置几分钟的作用
可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；
抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；
低温有利于增加DNA的柔韧性，减少其断裂；
四、方法步骤：
探究·实践·DNA的粗提取与鉴定
3.预冷酒精析出DNA或离心收集沉淀中的DNA
在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2-3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；或将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。
(1)搅拌时应轻缓、并沿一个方向
减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子
(2)酒精预冷的作用:同“低温放置的作用”
四、方法步骤：
探究·实践·DNA的粗提取与鉴定
4.NaCl溶液溶解DNA并鉴定
取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCI溶液中。向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。
溶液蓝色的深浅与溶液中DNA的含量的多少有关
加入2mol/L氯化钠溶液
不加入丝状物
加入4ml二苯胺试剂
加入2mol/L氯化钠溶液
加入丝状物
加入4ml二苯胺试剂
实验组
对照组
水浴加热
四、方法步骤：
1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？
结果分析与评价
观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。
本实验粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。
本实验可以采取分组的方式进行。可以选取不同的实验材料；也可以查阅资料了解其他提取DNA的方法，对同种材料采用不同的方法。最后从多方面比较实验结果，如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺试剂显色的深浅等，看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好。
2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？
3.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同，分析产生差异的原因。
思考：如果选用鸡血细胞进行实验，如何快速破碎细胞？
将鸡血细胞置于蒸馏水中，待细胞涨破后，收集滤液。
利用蛋白酶分解杂质蛋白，不分解DNA，有利于DNA与蛋白质分开。
进一步纯化DNA——用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐溶液中不能溶解的杂质；用低盐溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。
有时会在DNA滤液中添加嫩肉粉（木瓜蛋白酶），这样有什么好处？
有时还会反复利用不同浓度的NaCl溶液来溶解、析出DNA，试猜想该操作的目的？
进一步探究
实验室提取纯度较高的DNA的方法有不少。例如，可以先添加质量分数为25%的SDS溶液，使蛋白质变性后与DNA分开；随后，加入氯仿—异丙醇混合液(体积比为24：1)，通过离心将蛋白质及其他杂质除去，取上清液；可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的黏稠液体。此外由于苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性，因此还可以先用苯酚处理，然后离心分层，这时DNA溶于上层水相，蛋白质变性后存在于酚层中，用吸管、微量移液器等实验用具就可以将两者分开。
刑侦破案
拓展：DNA提取的应用
基因组测序
插入人胰岛素基因的大肠杆菌
基因工程
亲子鉴定
1.下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是( )
A.DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂
B.预冷的乙醇溶液可用来粗提取DNA
C.用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热
D.鉴定DNA时，应将丝状物直接加入到二苯胺试剂中进行沸水浴
课堂练习
D

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