资源简介

(共36张PPT)
第2节 基因工程的基本操作程序
第3章 基因工程
学习目标 核心素养
阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。 1.科学思维：结合生产实例，举例说出基因工程的基本操作程序。
2．科学探究：针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步设计。
一、 基因工程的基本操作程序
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
前提
核心
关键
保证
思考:获得目的基因之后直接转入受体吗？
不是
游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因。
(二)基因表达载体的构建（核心）
1.操作目的：让目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
2.基因表达载体的构成
启动子
目的基因
限制酶切割位点
复制原点
标记基因
终止子
（若需要能完成自主复制，还应有复制原点）
目的基因
启动子
终止子
标记基因
（1）启动子
(二)基因表达载体的构建（核心）
2.基因表达载体的构成
启动子
目的基因
限制酶切割位点
复制原点
标记基因
终止子
思考:表达载体为什么一定要有启动子？
生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能有利于基因的表达；通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体细胞无法转录。
启动子：位于基因首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA。
操纵基因
结构基因
启动子
RNA聚合酶
（1）启动子
(二)基因表达载体的构建（核心）
2.基因表达载体的构成
启动子
目的基因
限制酶切割位点
复制原点
标记基因
终止子
①本质:一段有特殊序列结构的DNA片段
②位置:位于基因的上游（首端），紧挨转录的起始位点。
③特殊类型：诱导型启动子。
④诱导型启动子的特点：当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达 。
（2）终止子
(二)基因表达载体的构建（核心）
2.基因表达载体的构成
启动子
目的基因
限制酶切割位点
复制原点
标记基因
终止子
①本质:一段有特殊序列结构的DNA片段。
②位置:位于基因的下游。
③功能：使转录在所需要的地方停下来。
（3）标记基因
①作用：是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的重组DNA分子细胞筛选出来。
②常见类型:抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。
启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
本质
位置
功能
补充：启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比
DNA片段
DNA片段
mRNA上三个相邻的碱基
mRNA上三个相邻的碱基
目的基因上游
目的基因下游
mRNA首端
mRNA尾端
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA
使转录在所需要的地方停下来
翻译的起始信号（编码氨基酸）
翻译的结束信号（不编码氨基酸）
质粒
启动子
限制酶切割位点
终止子
标记基因
复制原点
限制酶
目的基因
限制酶切割位点
限制酶
获取目的基因
连接酶
重组DNA分子
载体（质粒）
含有目的基因的DNA片段
同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割
带有黏性末端（或平末端）的切口
带有相同黏性末端（或平末端）的目的基因片段
DNA连接酶
重组DNA分子
（重组质粒）
基因表达载体构建模式图
(二)基因表达载体的构建（核心）
3.基因表达载体的构建过程
思考：切割载体和切割含有目的基因的DNA片段的限制酶应符合什么条件？
为什么？
应为同种限制酶或能产生相同末端的限制酶；
产生相同的黏性末端或平末端，以便通过DNA连接酶连接；
不一定，载体和目的基因都可能出现自身环化；
三种：载体-载体、目的基因-目的基因、载体-目的基因
用同一种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA，再用DNA连接酶处理后，一定会形成重组DNA分子吗？
用同一种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA，再用DNA连接酶处理后，可能有几种产物（只考虑两两连接）？
思考：用同一种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA，再用DNA连接酶处
理后，形成的“载体-目的基因”产物一定符合要求吗？
不一定，目的基因可能反向连接到质粒上。
同时用两种限制酶切割含目的基因的DNA片段和载体（使得目的基因的一端与载体一端的黏性末端相同，而目的基因的另一端与载体另一端的黏性末端相同）。
这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定哪些基因导入了受体细胞。
如何避免上述问题？
将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，效果会怎样？
一、 基因工程的基本操作程序
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
前提
核心
关键
保证
为何要把重组质粒导入受体细胞？
受体细胞可以分为那些类型？依据他们的结构与功能推测，导入方法相同吗
如何选择受体细胞，才能让转基因猴全身体细胞都带有目的基因？
培育抗虫棉时也必须选用这种细胞吗，为什么？
(三) 将目的基因（重组质粒）导入受体细胞
1.将目的基因导入植物细胞—花粉管通道法
①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；
②在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
受体细胞：受精卵
地位：我国科学家独创
实例：将Bt基因导入棉花细胞
“转化”概念：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。
农杆菌生活在土壤中的微生物，自然条件下可侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
(三) 将目的基因（重组质粒）导入受体细胞
2.将目的基因导入植物细胞—农杆菌转化法
1.将新鲜的从叶片上取下的圆形小叶与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株；
2.将花序直接浸没在含农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定。
(三) 将目的基因（重组质粒）导入受体细胞
2.将目的基因导入植物细胞—农杆菌转化法
农杆菌转化法示意图
Ti质粒
目的基因
构建基因表达载体
含目的基因的重组Ti质粒
转入
农杆菌
导入
植物细胞
目的基因插入染色体DNA中
植物细胞
表现出新性状的植株
植物组织培养
农杆菌转化法的实验思路（过程）：将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上，使目的基因能够维持稳定和表达。
农杆菌转化法示意图
农杆菌转化法的实验思路（过程）：将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上，使目的基因能够维持稳定和表达。
两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。
农杆菌转化法示意图
农杆菌转化法的实验思路（过程）：将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上，使目的基因能够维持稳定和表达。
两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌；第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞（非人工操作）。
适用于单子叶植物
基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。
(三) 将目的基因（重组质粒）导入受体细胞
3.将目的基因导入到植物细胞中方法--基因枪法
由于不同转基因产品所需要的目的基因不同，受体细胞又有植物、动物、微生物之分，因此基因表达载体的构建方法不是千篇一律的,将目的基因导入受体细胞的方法也不是完全相同的。
(三) 将目的基因（重组质粒）导入受体细胞
4.将目的基因导入动物细胞——显微注射法
利用显微注射将目的基因注入动物受精卵中（因为受精卵容易表现出全能性），这个受精卵将发育成具有新性状的动物。将目的基因导入动物受精卵最有效的方法。
显微注射
将目的基因注射到动物受精卵中
（1）受体细胞：常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌最广泛。
优点：繁殖快、单细胞、遗传物质相对较少、易于培养。
（2）Ca2+处理法（感受态细胞法）的一般过程
Ca2+处理大肠杆菌
使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
将重组的基因表达载体导入其中
Ca2+的作用：增加细胞壁的通透性
这种细胞称为感受态细胞
一般利用温度变化导入
(三) 将目的基因（重组质粒）导入受体细胞
5.将目的基因导入微生物细胞——Ca2+处理法
思考：当真核生物的基因以原核生物作为受体细胞时。
真核生物的基因有内含子，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，因此无法表达出该蛋白。
使用cDNA作为目的基因或使用酵母菌等真核生物作为受体细胞。
原核生物缺少高尔基体和内质网等细胞器，无法对真核生物的蛋白质进行正确的加工。
人工体外再加工或使用酵母菌等真核生物作为受体细胞
若无法获得该蛋白，原因可能是什么？
若可以获得该蛋白，但是蛋白质无活性，原因可能是？
以上情况如何解决？
以上情况如何解决？
实例：利用转基因大肠杆菌生产药物
原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。
一、 基因工程的基本操作程序
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
前提
核心
关键
保证
目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。
生物大分子具有特异性
----分子水平的检测
特定基因控制特定性状,如抗虫、抗旱等
----性状水平的检测
检测—
鉴定——
3.检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
2.检测目的基因是否转录出了mRNA
1.检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因
(四) 目的基因的检测与鉴定
1.分子水平
检测目的基因
DNA分子杂交
检测mRNA
检测表达的蛋白质
分子杂交
抗原—抗体杂交
PCR反应
PCR反应
标记基因
标记基因
(四) 目的基因的检测与鉴定
(1)首先取出转基因生物的基因组DNA；
检测目的基因:DNA分子杂交
(2)将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针；
(3) 使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中。
基因探针:简称探针，是一段带有检测标记（同位素、荧光分子或化学发光催化剂），且顺序已知的，与目的基因互补核酸序列(DNA或RNA)。
15N
15N
变性
变性
1.分子水平
(四) 目的基因的检测与鉴定
检测目的基因是否转录出了mRNA:DNA分子杂交
用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA。
1.分子水平
(四) 目的基因的检测与鉴定
检测表达的蛋白质:抗原—抗体杂交
15N
15N
变性
变性
DNA分子杂交
基因探针
待测DNA
单链DNA或RNA片断，带有某种标记，能与目标DNA或RNA的一条链发生碱基互补配对。
抗原—抗体杂交
分子杂交
（2）方法:RNA分子杂交
（3）方法:抗原—抗体杂交
鉴定——
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。
2.个体水平
(四) 目的基因的检测与鉴定
若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。
补充思考：在抗原-抗体杂交中，目的蛋白是作为抗原还是抗体？
抗原
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒（菌）植物
抗盐植物
抗除草剂植物
获取目的基因产物的转基因生物
饲喂害虫（抗虫接种实验）
害虫死亡
病毒（菌）感染（抗病接种实验）
未侵染上病斑
盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
功能、活性正常
个体生物学水平的鉴定具体有哪些做法？
1.质粒上的抗性基因在基因工程中的主要作用是( )
A.使目的基因在受体细胞内易于表达
B.使受体细胞具有抗药性
C.有利于对目的基因是否导入受体细胞进行检测
D.促进目的基因与导入的外源基因相连接，提高转基因操作的成功率
课堂练习
C
2.下列有关基因工程中目的基因的检测与鉴定的说法错误的是( )
A.通过PCR等技术检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因
B.通过PCR等技术检测目的基因是否转录
C.检测目的基因是否表达用抗原——抗体杂交的方法
D.目的基因的检测与鉴定是基因工程的核心步骤
D
3.科学家已能运用基因工程技术，让羊合成并由乳腺分泌抗体，相关叙述中正确的是( )
①该技术将导致定向变异；②DNA连接酶能把目的基因与载体黏性末端的碱基对连接起来；③将目的基因导入受体细胞时采用显微注射技术；
④受精卵是理想的受体。
A.①②④ B.①③④ C.②③④ D.①②③④
4.采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的方法正确的是（ ）①将毒素蛋白注射到棉受精卵中；②将编码毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中；③将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组，导入农杆菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养；④将编码毒素蛋白的DNA序列与细菌质粒重组，借助花粉管通道进入受精卵。
A.①② B.③④ C.②③ D.①④
B
B
课堂练习

展开更多......

收起↑