资源简介

(共29张PPT)
总大肠菌群的测定
水处理工艺单元进出水监测
大肠菌群的测定
任务10
（1）整洁、有序、规范；（2）多实践、巧动手，严格执行无菌操作；（3）培养实事求是、严谨认真的科学态度；善于观察、分析问题。
知识目标
素质目标
（1）理解大肠菌群作为水的环境卫生学指标的意义（2）理解大肠菌群的生化特征；（3）掌握多管发酵法测定水样中大肠菌群原理和方法。
能力目标
（1）熟练进行水样稀释、微生物接种的无菌操作；（2）能熟练操作平板分离、革兰氏染色，会MPN查表；（3）能独立完成大肠菌群的测定。
教学目标
主要内容
多管发酵法的原理
2
水中总大肠菌群的测定方法
3
注意事项与思考题
4
总大肠菌群的环境卫生学意义
1
1.1 为什么要检测水体的总大肠菌群
水体的细菌性污染主要来源于人畜粪便，大肠菌群与水中的多数病原菌（如沙门氏菌、志贺氏菌、霍乱弧菌等）存活期相近；
水中病原菌含量少，要从数量巨大的细菌中一一检测出少量病原菌，难以直接检测水体中的病原菌；
大肠菌群与病原菌都主要来自于粪便，大肠菌群分布广泛、数量多，存活时间长，操作简便，容易检出、容易观察。
大肠菌群是水体粪便污染的理想指示生物。
1.2 大肠菌群的环境卫生学意义
只要检测出水样中的总大肠菌群，就可知道该水体被粪便污染的程度，从而间接判断肠道病原菌在水体中在的概率。
霍乱弧菌(×2000)
沙门氏菌
大肠菌群是一群好氧或兼性厌氧，在37℃培养24～48h、能发酵乳糖产酸并产气、革兰氏阴性、无芽孢杆菌；
大肠菌群广泛分布各类水体、易培养、易观察。
1.3 大肠菌群的基本特征
主要内容
大肠菌群及其卫生学意义
1
多管发酵法测大肠菌群的原理
2
水中大肠菌群的测定方法
3
注意事项与思考题
4
根据大肠菌群特性：能发酵乳糖产酸、产气，G-，无芽孢杆菌
2.1 多管发酵法的原理
有大肠菌群？是？
不产酸不产气
无大肠菌群
有大肠菌群？是？
24h
产酸不产气
产酸产气
革兰氏染色
阴性
是大肠菌群
24h
37℃
革兰氏染色
阴性
是大肠菌群
乳糖培养液
发酵呈阳性
水样中大肠菌群数量如何确定？
多管发酵法用最可能数（Most Probable Number，简称MPN ）来表示试验结果的。利用泊松分布原理，根据发酵阳性管的数量，估计出水样中大肠菌群的最可能数（MPN），再经过证实和确认检测，预测出水样中的总大肠菌群数。
2.1 多管发酵法的原理
实验材料及仪器
1）乳糖蛋白胨培养液（加溴甲酚紫指示液）；紫色—黄色
2）三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液；
3）伊红美蓝培养基（EMB培养基）—深紫色有金属光泽菌落；
4）革兰氏染色剂；
5）显微镜，烧瓶、大试管、发酵小套管、培养皿、移液管、无菌水等。
2.2 多管发酵法检测的准备
1）自来水水样：先将水龙头用火焰烧灼3min灭菌，放掉管中积水5min，再用无菌容器接水样后，立刻送检。
2）地表水水样：将无菌的具塞玻璃瓶瓶口向下，浸入距水面10～15cm深处，翻转瓶子，拔掉玻璃塞，水样流入瓶中后，将瓶塞塞好，再从水中取出后，立刻送检。
2. 水样的采集
主要内容
大肠菌群及其卫生学意义
1
水中大肠菌群的测定方法
3
注意事项与思考题
4
水中大肠菌群的测定
3
多管发酵法测大肠菌群的原理
2
1. 初发酵阶段
1） 取水样300ml分别加入12个发酵瓶：2个含有50ml三倍乳糖发酵烧瓶各加100 ml水样；10个含有5 ml三倍乳糖发酵管各加10 ml水样，混匀。2） 在37℃培养24h至48 h，查看发酵结果。
3.1 生活饮用水的大肠菌群测定
24h产酸产气
48h不产酸产气
存在大肠菌群
三倍乳糖5ml/管
接种水样各100ml
三倍乳糖50ml/管
接种水样各10ml
水样
2. 证实：产酸产气的细菌是G-
将产酸产气的混合液平板划线，接种至伊红美蓝培养皿，培养24h后，选取深紫色有金属光泽的菌落进行革兰氏染色。
24h产酸产气
有大肠菌群存在
划线接种至
伊红美蓝培养基
37℃培养24h
革兰氏
染色
3. 确认
将平板划线分离、染色呈阴性的菌落接种到乳糖发酵管，进行复发酵试验，确认发酵管中有大肠菌群存在。
革兰氏
染色
乳糖发酵
10ml
37℃培养24h
产酸产气
发酵呈阳性
整个操作从初发酵、培养、划线分离、染色到复发酵，至少需要4天。
三倍浓缩乳糖5ml/管
接种水样各100ml
三倍浓缩乳糖50ml/管
接种水样各10ml
水样
37℃培养24h
24h产酸产气
48h产酸产气
48h不产酸产气
无大肠菌群存在
有大肠菌群存在
可疑
划线接种至
伊红美蓝培养基
37℃培养24h
初发酵试验（检验）
平板分离（证实）
复发酵实验
（确认）
革兰氏
染色
乳糖发酵
10ml
产酸、产气者，有大肠菌群
37℃培养24h
饮用水水样的检测过程
10ml水量的阳性管数 100ml水量中的阳性管数 10ml水量的阳性管数 100ml水量中的阳性瓶数 0 1 2 0 1 2
0 <3 4 11 6 22 36 92
1 3 8 18 7 27 43 120
2 7 13 27 8 31 51 161
3 11 18 38 9 36 60 230
4 14 24 52 10 40 69 >230
5 18 30 70
注：水样总量300ml（2份100ml，10份10ml），此表用于测定生活饮用水。
4. 检索MPN表，确定总大肠菌群数
根据发酵阳性管数量，确定出水样中总大肠菌群的最可能数（MPN）。
向装有5mL乳糖培养液的5个发酵管分别加入10mL水样；向装有10mL乳糖培养液的5个发酵管分别加入1mL水样；向装有10mL乳糖培养液的5个发酵管分别加0.1mL水样，混匀。（共计15管总水样55.5mL）
3. 2 地表水中大肠菌群的多管发酵法测定
三倍浓缩乳糖5ml/管
接种水样各1ml
接种水样各0.1ml
接种水样各10ml
池水、河水、湖水等地表水的水样
37℃培养24h
24h产酸产气
48h产酸产气
48h不产酸产气
无大肠菌群存在
有大肠菌群存在
可疑
划线接种至
伊红美蓝培养基
37℃培养24h
初发酵试验（假设检验）
平板分离（证实）
复发酵实验
（确认）
革兰氏
染色
乳糖发酵
10ml
产酸、产气者，有大肠菌群
37℃培养24h
三倍浓缩乳糖5ml/管
接种水样各1ml
接种水样各0.1ml
接种水样各10ml
根据发酵阳性管数，查“总大肠菌群MPN检索表”，可确定每100mL水样中存在的总大肠菌群数。
我国监测标准是以1L为报告单位，故MPN值再乘以10，就是每升水中的总大肠菌群数。
单位：MPN/L
总大肠菌群MPN检索表
如：某水样接种10mL的5管均为阳性；接种1mL的5管中有2管为阳性；接种0.1mL的5管均为阴性。
从MPN表中检索5～2～0对应的MPN，得知100mL水样中的总大肠菌群数为49个，
故：1L水样中的总大肠菌群数为49×10=490个/L。
滤膜是一种微孔性薄膜（孔径0.45μm），将水样注入已灭菌的放有滤膜的滤器中，经过抽滤，细菌被截留在滤膜上，然后将滤膜贴在M-FC培养基上，37℃培养，计数滤膜上生长的细菌数，计算出1L水样中含有总大肠菌群数。
3.3 滤膜法检测大肠菌群
1. 测总原理
放在琼脂培养基上培养
放在液体培养基上培养
放在NPS上培养
M-FC 培养基的制备、消毒。
水样量选择：根据细菌受检验的特征和水体污染程度。理想的水样体积是一片滤膜上生长大肠菌群菌落不超过200个。
滤膜及滤器的灭菌：121℃高压蒸汽灭菌30min。
安装过滤装置：以无菌操作装好过滤装置。
2. 检测方法
过滤：在滤床上贴放滤膜，将水样注入滤器中，加盖，开动真空泵抽滤。
培养：将滤膜置于M-FC琼脂或吸收垫表面，于37℃经24h±2h 培养。
计算：大肠菌群菌落在M-FC 培养基上呈蓝色或蓝绿色，计数呈蓝或蓝绿色的菌落，计算出每1L 水样中的粪大肠菌群数。
3. 滤膜法测粪大肠菌群流程
m FC NPS
MacConkey NPS
大肠杆菌
大肠杆菌
大肠杆菌
Teepol NPS
河水培养
废水中的大肠菌群
废水中的大肠菌群
主要内容
注意事项与思考题
4
大肠菌群的环境卫生学意义
1
多管发酵法测大肠菌群的原理
2
水中大肠菌群的测定方法
3
测定粪大肠菌群的培养温度为44.5℃，其余操作不变。
为什么选择大肠菌群作为水的环境卫生学指标？
多管发酵法测定总大肠菌群的优缺点是什么？
大肠菌群检测结果表达阴性和未检出有什么区别？
水中若有大量的致病菌-霍乱弧菌，用此法检测总大肠菌群能否得到阳性试验结果，为什么？

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