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(共31张PPT)
微专题9
PCR技术的热点考法归纳及融合基因的原理和应用
一、PCR技术的热点考法归纳
1.荧光定量PCR
例1 荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种DNA的含
量,其原理是在PCR体系中每加入一对引物的同时加入一
个与某条模板链互补的荧光探针,当耐高温的DNA聚合酶
催化子链延伸至探针处,会水解探针,使荧光监测系统接收
到荧光信号,即每扩增一次,就有一个荧光分子生成。下列叙述错误的是 (　)
A.引物与探针均具有特异性,与模板结合时遵循碱基互补配对原则
B.反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈负相关
C.耐高温的DNA聚合酶催化DNA合成的方向总是从子链的5'端到 3'端
D.若用上述技术检测某基因的转录水平,则需要用到逆转录酶
B
[解析]引物与探针均具有特异性,与模板结合时遵循碱基互补配对原则,A正确;
模板DNA含量越高,PCR扩增过程中形成的荧光分子越多,因此荧光强度越大,即反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈正相关,B错误;
耐高温的DNA聚合酶催化DNA合成的方向总是
从子链的 5' 端到 3' 端,C正确;
若要用荧光定量PCR技术检测某基因的转录水
平,即检测细胞中 mRNA的含量,则先要将mRNA
逆转录形成DNA再检测,故需要用到逆转录酶,D正确。
2.RT-PCR
例2 逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中,一条RNA链被逆转录成为互补DNA,再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。下列关于RT-PCR的叙述,正确的是 (　)
A.RT-PCR所用的酶包括逆转录酶和Taq DNA聚合酶
B.RT-PCR所用的两种引物序列不同,两者间可互补配对
C.RT-PCR反应过程中需要解旋酶解旋
D.正常情况下至少经过3次循环,方可获取与目的基因等长的DNA单链
A
[解析]根据题干信息,RT-PCR所用的酶包括逆转录酶和Taq DNA聚合酶,
A正确;
两种引物之间不能互补配对,否则不能正常发挥作用,B错误;
PCR反应过程中高温即可解旋,不需要解旋酶解旋,C错误;
正常情况下至少经过2次循环,方可获取与目的基因等长的DNA单链,
D错误。
3. PCR定点突变技术——大引物PCR
例3 [2023·山东青岛三模] 大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR即可获得,第一轮加诱变引物和侧翼引物,第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物,如图表示利用大引物PCR对基因M进行定点诱变。下列说法错误的是 (　)
A.第一轮PCR中,至少需要2个循环才能获得相应的大引物
B.第二轮PCR所用的引物是第一轮PCR的产物DNA的两条链
C.扩增的定点诱变产物通常需具备启动子、终止子等结构
才能进行转录和翻译
D.为了使两轮PCR在同一支试管中进行,设计引物时应考虑不同的复性温度
B
[解析]第一轮PCR中,需要先合成一条链(即诱变引物延伸的子链),再用这条链合成互补链(大引物),至少需要2个循环才能获得相应的大引物,A正确;
第一轮产物DNA的一条链作第二轮PCR扩增的大引物,第二轮PCR仍需加入的另一种引物是侧翼引物,B错误;
若要使目的基因可以表达出蛋白质,则PCR扩增的定点
诱变产物上需具备启动子和终止子,诱导基因转录和翻
译,C正确;
为了使两轮PCR反应在同一支试管中进行,引物设计时
应考虑不同的复性温度,第二轮PCR的复性温度应该比
第一轮高,D正确。
4.重叠PCR技术
例4 [2023·辽宁大连一模] “多发性骨性连接综合征”是由编码成纤维细胞生长因子(FGF9)的基因突变所致,患者FGF9基因中某碱基对发生替换,使FGF9中相应的氨基酸发生替换。科研人员欲利用基因工程等技术获得含有该突变基因的模型小鼠,用来研究该病的发病机理。图甲表示将FGF9 cDNA(由FGF9基因转录得到的mRNA逆转录而来)进行定点突变得到突变型FGF9 cDNA的流程,图乙为研究中所用的质粒(SpeⅠ、HindⅢ、SmaⅠ和BglⅡ分别代表相应的限制酶切割位点,以上限制酶切割产生的黏性末端不同)。请回答下列问题:
(1)图甲虚线方框中的a链与d链在延伸过程中的作用是既可作为　　　　又可以起到相当于　　　的作用,使　　　　　　　　　　酶能够从a链与d链的3'端开始连接脱氧核苷酸。
模板
引物
耐高温的DNA聚合
[解析] (1)由题图分析可知:图甲虚线方框中的a链与d链在延伸过程中的作用是既可作为模板,又可以起到相当于引物的作用,使耐高温的DNA聚合酶能够从a链与d链的3'端开始连接脱氧核苷酸。
(2)图乙质粒中的C序列是　　　　,它是RNA聚合酶识别和结合的部位。图甲中突变型FGF9 cDNA的a链所在的DNA单链为转录的模板链,则引物1和引物4的5'端需分别添加　　　　　　　　(酶)的识别序列,才能与图乙中的质粒正确连接。
启动子
HindⅢ和SpeⅠ
[解析] (2)图乙质粒中的C序列是启动子,位于目的基因的上游,紧挨转录的起始位点,是RNA聚合酶识别和结合的部位。图甲中突变型FGF9 cDNA的a链所在的DNA单链为转录的模板链,为了保证目的基因在启动子和终止子之间且质粒上需要保留启动子、终止子、复制原点和至少一个标记基因,使用双酶切可以避免载体自身环化,因此选用HindⅢ和SpeⅠ切割质粒,为了便于目的基因和质粒连接,需要用相同的酶切割目的基因,以产生相同的黏性末端,所以引物1和引物4的5'端需分别添加HindⅢ和SpeⅠ的识别序列,才能与图乙中的质粒正确连接。
5.反向PCR测定未知DNA区域
例5 如果已知一小段DNA的序列,
可采用PCR的方法,简捷地分析出已
知序列两侧的序列,具体流程如下图
(以EcoRⅠ酶切为例):
请据图回答问题:
(1)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物,步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是　　　　(从引物①②③④中选择,填编号)。
②④
DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
已知 序列
PCR 引物 ①5'-AACTATGCGCTCATGA-3'
②5'-GCAATGCGTAGCCTCT-3'
③5'-AGAGGCTACGCATTGC-3'
④5'-TCATGAGCGCATAGTT-3'
[解析] (1)PCR引物是一小段单链核苷酸序列,引物5'端的碱基可以与DNA模板链的3'端的碱基进行碱基互补配对,可作为DNA复制的起始点,子链的延伸方向为5'→3',据题图分析,结合片段F的已知序列可知,能与已知序列左边配对的引物为④,能与已知序列右边配对的引物为②,故步骤Ⅲ选用的PCR引物应为②④。
(2)对PCR产物测序,经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列),结果正确的是　　　　。
B
[解析] (2)对PCR产物测序,得到片段F的完整序列,因为片段F是被限制酶EcoRⅠ剪切形成的,它识别的序列是GAATTC,且在G与A之间切割,切割之后对DNA两端的黏性末端进行了补齐,所以5'端应该是AATTC,3'端是GAATT,故选B。
6.巢式PCR
例6 为减少引物与模板之间的非特异性配对,人们对普通PCR技术进行了改良,发明了巢式PCR技术,其原理是利用两套引物进行两轮PCR扩增。首先利用第一对引物(外引物)对目的基因所在的DNA进行第一轮扩增(经过15~30次循环),第二轮扩增以第一轮扩增产物为模板,利用
第二对引物(内引物或巢式引物)结合在第
一轮扩增产物内部,经过15~30次循环,获得
第二轮扩增片段(即目的基因),最终第二轮
扩增片段短于第一轮,基本过程如图所示。
下列叙述错误的是 (　)
A.两对引物的碱基序列不相同,但均应为单链DNA片段
B.使用外引物至少经过3次循环,才能得到图示的第一轮扩增产物
C.若第一轮扩增产生错误片段,则其进入第二轮扩增的概率极低
D.与巢式PCR相比,普通PCR特异性更强,错误率更高
√
[解析]两对引物的碱基序列不相同,但均应为单链DNA片段,以便与模板互补配对,A正确;
根据DNA的半保留复制的特点,可知PCR前两轮循环产生的四个DNA分子的两条链均不等长,第三轮循环产生的DNA分子存在等长的两条核苷酸链,即仅含引物之间的序列,因此,至少经过3次循环才能得到图示的第一轮扩增产物,B正确;
由于内引物扩增模板是外引物扩增后的产物,第二轮反应能否进行,也是对第一轮反应正确性的鉴定,如果第一轮扩增产生了错误片段,则第二轮能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低,C正确;
巢式PCR中加入的组分与常规PCR相同,都含有模板、引物、热稳定的DNA聚合酶、四种游离的脱氧核苷酸、缓冲液、Mg2+等,第一轮扩增中,外引物用以产生扩增产物,此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增,从而提高反应的特异性,获得的产物特异性更强,D错误。
二、融合基因的原理和应用
视野拓展:基因融合是指将两个或多个基因的编码区首尾相连,置于同一套调控序列(包括启动子、增强子、核糖体结合序列、终止子等)控制之下,构成融合基因。
1.融合基因的构建
例7 我国科研人员利用光遗传学开关控制细胞内的代谢过程,尝试对糖尿病精准治疗。
(1)细胞质基质中的光敏色素(P)是植物细胞的光信号受体,被红光激活后,其　　　　　　发生改变。与核输入蛋白(F)结合形成复合体,复合体会被转运到细胞核中。远红光会诱导P和F分离。
空间结构
[解析] (1)光敏色素是一类色素—蛋白复合体,被红光激活后,其空间结构发生改变。
(2)受此启发,科研人员拟构建用于哺乳动物的红光/远红光诱导的开关系统。Gal4蛋白能与诱导型启动子UAS结合,但不能单独激活UAS 下游的基因转录,VP蛋白不能与UAS结合但可以激活转录。
①为实现UAS控制的胰岛素基因表达的光调控,需要构建的两种融合基因是　　　　。
a.P-F融合基因 b.P-Gal4融合基因 c.F-Gal4融合基因
d.F-VP融合基因 e.Gal4-VP融合基因
bd
[解析] (2)①结合题干“Gal4蛋白能与诱导型启动子UAS结合,但不能单独激活UAS下游的基因转录,VP蛋白不能与UAS结合但可以激活转录”与“细胞质基质中的光敏色素(P)是植物细胞的光信号受体,被红光激活后与核输入蛋白(F)结合形成复合体,复合体会被转运到细胞核中”可知,为实现UAS控制的胰岛素基因表达的光调控,需要将激活性质的P与Gal4基因融合,将协助转运的F(可进入细胞核)与激活转录的VP基因融合,故选b、d。
②将上述两种融合基因和UAS控制的胰岛素基因导入一种通用受体细胞——人胚肾细胞后,在红光照射下,细胞内形成　　　　 　　　　复合体,招募细胞内的　 　　　酶与UAS结合,启动下游胰岛素基因的表达。
Gal4-P-F-VP(或VP-F-P-Gal4)
[解析] ②结合题干“P被红光激活后,其空间结构发生改变,与F结合形成复合体”可知两种融合基因的表达产物可结合形成Gal4-P-F-VP(或VP-F-P-Gal4)复合体;结合题干“Gal4蛋白能与诱导型启动子UAS结合”,启动子是转录的起点,转录时RNA聚合酶会识别并结合启动子,开始转录,驱动相关基因的表达。
RNA聚合
例8 [2023·北大附中模拟] 癫痫是一种间歇发作的神经系统疾病,发作时表现为大脑特定区域神经元兴奋性持续增强。研究人员发现神经元中C蛋白的表达量可指示神经元兴奋性变化。
(1)将C蛋白和绿色荧光蛋白融合基因导入作为　　　　的腺相关病毒,感染小鼠神经元。
载体
[解析] (1)某些病毒可以作为目的基因的载体,可将C蛋白和绿色荧光蛋白融合基因作为目的基因导入腺相关病毒,感染小鼠神经元。
(2)研究人员用特定药物诱导小鼠癫痫发作,出现绿色荧光的神经元兴奋性　　　　　　。K+通道蛋白广泛分布于中枢神经系统,激活后可促进K+大量外流并抑制突触前膜释放神经递质。研究人员构建C蛋白、绿色荧光蛋白和不同K+通道蛋白的融合基因并转入体外培养的神经元中。K+通道蛋白基因的插入位点应为图中的　　　　(选取图中序号)。
持续增强
C
[解析] (2)癫痫是一种间歇发作的神经系统疾病,发作时表现为大脑特定区域神经元兴奋性持续增强,神经元中C蛋白的表达量可指示神经元兴奋性变化,将C蛋白和绿色荧光蛋白融合基因作为目的基因导入腺相关病毒,感染小鼠神经元,研究人员用特定药物诱导小鼠癫痫发作,出现绿色荧光的神经元兴奋性持续增强。K+通道蛋白基因的插入位点在C基因和绿色荧光蛋白基因之间,即图中的C位置,才能构建C蛋白、绿色荧光蛋白和不同K+通道蛋白的融合基因并使其在体外培养的神经元中表达。
2.融合基因的检测与鉴定
例9 B基因存在于水稻基因组中,其在体细胞和精子中正常表达,在卵细胞中不转录。为研究B基因表达
对卵细胞的影响,设计并完成了
如下实验来获取能够在卵细胞
中表达B基因的转基因植株。
请回答下列问题:
注:Luc基因表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光
(1)可利用　　　　　　 　　(细胞)中的RNA和PCR技术获取大量的B基因,该过程需要用到　　　　　　　　　　　　　　　酶;获得B基因中编码蛋白的序列后,将该序列与Luc基因连接成融合基因(表达的蛋白质能保留两种蛋白质各自的功能),然后构建基因表达载体。
水稻体细胞或精子
逆转录酶和耐高温DNA聚合
[解析] (1)B基因只在水稻体细胞和精子中正常表达,合成相应的RNA,所以从水稻体细胞和精子中提取的RNA才能逆转录得到B基因,该过程需要用到逆转录酶,PCR过程中需要高温处理,所以需要耐高温DNA聚合酶。
(2)外植体经　　 　　形成的水稻愈伤组织放入农杆菌液浸泡后进行植物组织培养,培养基中需加入　　　 　进行筛选。个体水平可以通过　　　　　　　　　　　 　　 　　　　　　筛选出能表达B基因的转基因植株。
脱分化
潮霉素
[解析] (2)外植体经脱分化形成愈伤组织。农杆菌在侵染植物时能将Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的细胞,并且将其整合到该细胞的染色体DNA上,而T-DNA上含有潮霉素抗性基因,所以可以用加潮霉素的培养基筛选出成功导入目的基因的受体细胞。根据注解可知,B基因与Luc基因连接形成B-Luc融合基因,Luc基因表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光,可以通过加入荧光素后检测该植株卵细胞中是否发出荧光,鉴定和筛选出能表达B基因的转基因植物。
加入荧光素后检测该植株卵细胞中是否发出荧光
例10 [2023·福建龙岩三模] 重组PCR技术是一项新的PCR技术,通过重组PCR技术能将两个不同的DNA连接成为一个新DNA分子。某科研小组从猪源大肠杆菌中扩增得到LTB和ST1两个基因片段,利用重组PCR技术构建了LTB-ST1融合基因,制备过程如下
图所示。回答下列问题:
(1)从P2、P3两种引物的角度分析,LTB和ST1基因能够融合的关键是
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。PCR1和PCR2不能在同一个反应体系中进行,原因是
　　 　　　　。②过程不需要加入引物,原因是
　　　 　。
这两种引物的部分区域能进行碱基互补配对
P2和P3能结合,会干扰引物和模板链的结合,影响PCR过程
[解析] (1)LTB和ST1基因能够融合的关键是P2和P3两种引物的部分区域能发生碱基互补配对;由于P2和P3两种引物能结合,引物之间的结合会干扰引物和模板链的结合,从而影响PCR过程,因此PCR1和PCR2不能在同一个反应体系中进行;②过程不需要加入引物,两条母链可以作为合成子链的引物,为DNA聚合酶提供3'端。
两条母链可作为合成子链的引物
(2)科研小组为了检测是否成功构建出融合基因,将反应后体系中的各种DNA分子进行电泳,结果如图所示。则融合基因最可能是　 ,判断依据
是
　　　　　 　　。
3
[解析] (2)PCR体系中存在融合和未融合的
DNA分子,融合的DNA包括了2个DNA分子
片段,其相对分子质量较大。根据电泳图可
知,3号DNA分子的相对分子质量最大,因此
3号DNA分子最可能是融合基因。
融合基因包含2个不同的基因,其相对分子质量较大,3表示的DNA相对分子质量最大

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