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第1章 发酵工程第3节发酵工程及其应用青霉素是世界上第一个应用于临床的抗生素。早期科学家只能从青霉菌中提取少量，价格贵如金。随着高产菌种的选育、发酵技术的发展等，青霉素步入了产业化生产的道路。如今，1瓶规格160万单位的青霉素注射剂的价格只要1元左右。在工业上，青霉素究竟是怎样生产的呢？从社会中来选育高产菌种扩大培养配制培养基灭菌接种发酵罐内发酵分离、提纯产物获得产品对发酵原理的认识微生物纯培养技术建立密闭式发酵罐成功设计严格控制环境条件（温度、pH、溶解氧、压强、营养物、泡沫等）大规模生产发酵产品微生物的特定功能现代化工程技术发酵工程是指利用微生物的特定功能，通过现代工程技术，规模化生产对人类有用的产品。它涉及菌种的选育和培养、产物的分离和提纯等方面。在青霉素生产过程中如果有杂菌污染，某些杂菌会分泌青霉素酶，将青霉素分解掉。
生产柠檬酸
生产啤酒
生产味精
黑曲霉
啤酒酵母
谷氨酸
棒状杆菌
在菌种确定之后，要选择原料制备培养基。在生产实践中，培养基的配方要经过反复试验才能确定。
接种
选育菌种
制备培养基
扩大培养
灭菌
发酵罐内发酵
分离、提纯产物
获得产品
性状优良的菌种可以从自然界中筛选出来，也可以通过诱变育种或基因工程育种获得。
工业发酵罐的体积一般为几十到几百立方米，接入的菌种总体积需要几立方米到几十立方米。所以，在发酵之前还需要对菌种进行扩大培养
发酵工程中所用的菌种大多数是单一菌种，一旦有杂菌污染，可能导致产量大大下降。因此，培养基和发酵设备都必须经过严格的灭菌。
现代发酵工程使用的大型发酵罐均有计算机控制系统，能对发酵过程中的温度、pH、溶解氧、罐压、通气量、搅拌、泡沫和营养等进行监测和控制；还可以进行反馈控制，使发酵全过程处于最佳状态。
电动机
排气管
pH计
冷却水排出口
冷却夹层
发酵液
搅拌叶轮
生物传感器装置
空气入口
放料管
阀门
培养物或营养物质的加入口
观察孔
取样管
温度传感器和控制装置
冷却水进入口
这是发酵工程的中心环节。在发酵过程中，要随时检测培养液中微生物的数量、产物的浓度等，以了解发酵进程。还要及时添加必需的营养组分，要严格控制温度、pH和溶解氧等发酵条件。
环境条件不仅会影响微生物的生长繁殖，而且会影响微生物代谢物的形成。
如果发酵产品是微生物细胞本身，可在发酵结束之后，采用过滤、沉淀等方法将菌体分离和干燥，即可得到产品。如果产品是代谢物，可根据产物的性质采取适当的提取、分离和纯化措施来获得产品。
一、发酵工程的基本环节
1.微生物菌种资源丰富，选择发酵工程用的菌种时需要考虑哪些因素？2.怎样对发酵条件进行调控以满足微生物的生长需要？思考·讨论：发酵工程基本环节分析①在低成本的培养基上能迅速生长繁殖；②生产所需代谢物的产量高；③发酵条件易控制；④菌种不易变异，退化等。①反复试验确定培养基的配方；②对培养基和发酵设备进行严格的灭菌；③随时检测培养液中微生物的数量、产物浓度等；④及时添加必需的营养组分；⑤严格控制温度、pH和溶氧量等发酵条件，使用计算机控制系统对各种条件进行监测和控制，以及反馈控制。3.在产物分离和提纯方面，发酵工程与传统发酵技术相比有哪些改进之处？4.在进行发酵生产时，排出的气体和废弃培养液等能直接排放到外界环境中吗？为什么？思考·讨论：发酵工程基本环节分析传统发酵技术很多时候不会再对产物进行分离和提纯处理，或者仅采用简单的沉淀、过滤等方法。不能。因为在进行发酵生产时，微生物及其代谢物中都可能含有危害环境的物质。要进行二次清洁或灭菌处理后才能排放。在发酵工程中使用的分离和提纯产物的方法较多：沉淀、萃取、膜分离、吸附和离子交换、液相层析法、结晶法等。右图是发酵工程常用的发酵罐的结构示意图，请据图回答下列问题。（1）在发酵前，需用法对整个发酵罐进行灭菌，为保证该过程的实施，整个发酵罐必须是的。（2）在发酵过程中，电动机不停带动搅拌叶轮转动，这样做的目的是。（3）冷却水是为了带走微生物进行产生的热量，以维持发酵液温度的稳定，若温度过高，会影响微生物，导致不能产生相应代谢产物，甚至死亡。高压蒸汽灭菌密封增加溶解氧，让微生物与营养物质充分接触，以保证微生物的营养供应细胞呼吸酶的活性现学现用生产条件温和原料来源丰富且价格低廉产物专一废弃物对环境的污染小和容易处理发酵工程的特点二、发酵工程的应用二、发酵工程的应用——1.在食品工业上的应用①生产传统的发酵产品酱油大豆（主要原料）黑曲霉（蛋白酶）小分子肽和氨基酸淋洗、调制a.酱油的生产谷物或水果酿酒酵母各种酒类b.各种酒类的生产微生物最早开发和应用的领域；产量和产值都居于发酵工业的首位。
发芽
1
2
焙烤
3
碾磨
4
糖化
大麦
水
糖化罐
大麦种子发芽，
释放淀粉酶。
加热杀死种子胚但不使淀粉酶失活。
将干燥的麦芽碾磨成麦芽粉。
淀粉水解
形成糖浆。
淀粉→麦芽糖→葡萄糖
思考·讨论：啤酒的工业化流程
蒸煮
5
6
发酵
7
消毒
8
终止
产生风味组分，终止酶的进一步作用，并对糖浆灭菌。
酵母菌将糖转化为酒精和CO2
杀死啤酒中的大多数微生物，延长它的保存期。
过滤、调节、分装啤酒进行出售。
糖浆
啤酒花
过滤
冷却
装瓶
装罐
储存罐
接种
思考·讨论：啤酒的工业化流程
思考·讨论：啤酒的工业化流程完成酵母菌的繁殖，大部分糖的分解和代谢物的生成在低温、密闭的环境下，储存一段时间1.与传统的手工发酵相比，啤酒的发酵生产过程中，哪些工程手段使啤酒的产量和质量明显提高？菌种的选育、对原材料的处理、发酵过程的控制、产品的消毒等。发芽焙烤碾磨糖化蒸煮发酵消毒终止主发酵后发酵2.现在市面上流行一种“精酿”啤酒，它的制作工艺与普通啤酒有所不同，如一般不添加食品添加剂、不进行过滤和消毒处理等。有人认为饮用“精酿”啤酒比饮用“工业”啤酒更健康，你怎么看待这个问题？“精酿”啤酒是小规模酿造产品，发酵时间长、产量低和价格高，却依然有着市场需求，我们如何辩证地看待大规模生产与小规模制作？应该辩证地看待这一产品。一方面：这类产品具有多样化的特点，能够满足一些人对独特口感的需求，或者满足一些人的时尚追求。另一方面：这类产品是手工作坊式生产的，存在啤酒品质不稳定，价格昂贵的问题。思考·讨论：啤酒的工业化流程现学现用我国是世界上啤酒的生产和消费大国。啤酒是以大麦为主要原料经酵母菌发酵制成的，其工业化生产流程如下图所示。（1）发酵工程一般包括菌种的选育、_________、培养基的配制、灭菌、接种、发酵、产品的分离、提纯等方面。啤酒酵母的新陈代谢类型是_________________。（2）在酿酒过程中常加入_________（填某种植物激素）以缩短大麦发芽的时间，从而减少有机物的消耗。焙烤阶段应注意控制温度，不能使_________失活。扩大培养 异养兼性厌氧型赤霉素淀粉酶现学现用（3）发酵阶段的底物是_________，发酵液和发酵设备都必须经过严格的_________处理。（4）请写出一条啤酒的发酵生产过程中，可以使啤酒的产量和质量得到明显提高的工程手段：（5）请写出一条发酵工程在食品工业、医药工业和农牧业等领域得到广泛应用的原因：葡萄糖灭菌随时检测培养液中的酵母菌数量、产物浓度；及时添加必需的营养组分；严格控制发酵温度、发酵时间、pH、溶解氧含量、罐压和搅拌速率等发酵条件生产条件温和；原料来源丰富且价格低廉；产物专一；废弃物对环境污染小、易处理添加剂类型举例酸度调节剂L-苹果酸、柠檬酸、乳酸增味剂5’-肌苷酸二钠、谷氨酸钠着色剂β-胡萝卜素、红曲黄色素增稠剂黄原胶、β-环状糊精、结冷胶防腐剂乳酸链球菌、溶菌酶添加了柠檬酸的饮料增加食品的营养改善食品的口味、色泽和品质延长食品的保存期食品添加剂的作用二、发酵工程的应用——1.在食品工业上的应用②生产各种各样的食品添加剂二、发酵工程的应用——1.在食品工业上的应用③生产酶制剂食品的直接生产改进生产工艺简化生产过程改善产品的品质和口味延长食品储存期提高产品产量b.酶制剂的作用α-淀粉酶β-淀粉酶果胶酶氨基肽酶脂肪酶……a.酶制剂的种类二、发酵工程的应用——2.在医药工业上的应用基因工程、蛋白质工程与发酵工程相结合动植物的基因微生物直接改造微生物转入微生物病原体的抗原基因转入发酵工程药物药物疫苗各种抗生素多种氨基酸多种激素多种免疫调节剂发酵工程生产的药物二、发酵工程的应用——3.在农牧业上的应用①生产微生物肥料利用了微生物在代谢过程中产生的、等来增进土壤肥力，改良土壤结构，促进植株生长；有的还可以抑制土壤中病原微生物的生长，减少病虫害的发生。有机酸生物活性物质利用根瘤菌和固氮菌生产的根瘤菌肥、固氮菌肥二、发酵工程的应用——3.在农牧业上的应用②生产微生物农药微生物农药是利用　　　或　　　来防治病虫害的。微生物农药作为　　　的重要手段。微生物其代谢物生物防治微生物或代谢产物防治病虫害种类苏云金杆菌80多种农林害虫白僵菌玉米螟、松毛虫一种放线菌产生的抗生素（井冈霉素）水稻枯纹病二、发酵工程的应用——3.在农牧业上的应用③生产微生物饲料微生物含有丰富的。蛋白质以淀粉或纤维素的水解液、制糖工业的废液等为原料，通过发酵获得了大量的，即单细胞蛋白，用单细胞蛋白制成的微生物饲料，能使家畜、家禽增重快，产奶或产蛋量显著提高。微生物菌体二、发酵工程的应用——4.在其他方面的应用利用纤维废料发酵生产酒精、乙烯等能源物质②对极端微生物（生活在高温、高压、高盐和低温等环境）的利用利用嗜热菌、嗜盐菌生产洗涤剂嗜低温菌有助于提高热敏性产品的产量①解决资源短缺与环境污染问题发酵工程正渗透到几乎所有的工农业领域，在助力解决、、和等方面的重大问题上，作出了越来越大的贡献。粮食环境能源健康一、概念检测与传统发酵技术相比，发酵工程的产品种类更加丰富，产量和质量明显提高。判断下列相关表述是否正确。1. 发酵工程与传统发酵技术最大的区别就是前者可以利用微生物来进行发酵。（ ）2. 发酵工程的产品主要包括微生物的代谢物、酶及菌体本身。（ ）3. 在发酵工程的发酵环节中，发酵条件变化不仅会影响微生物的生长繁殖，也会影响微生物的代谢途径。（ ）4. 通过发酵工程可以从微生物细胞中提取单细胞蛋白。（ ）××√√1.在青霉素的发酵生产过程中，人们遇到了两个问题。请你运用所学知识或查阅资料，并发挥想象力，提出解决这些问题的思路。（1）青霉素发酵是高耗氧过程，如何能够保证在发酵过程中给微生物持续高效地供氧呢？（提示：血红蛋口具有携带O2的能力）（2）在发酵过程中，总有头孢霉素产生。人们通过对青霉素生产菌代谢途径的研究发现，在青霉素与头孢霉素的合成过程中，它们有一个共同的前体，这个前体经过两种不同酶的作用分别合成两个产物。如何改造青霉素生产菌使其只生产青霉素，或者只生产头孢霉素呢？可以用基因工程的方法，将血红蛋白基因转入青霉素生产菌来提高菌体对氧的吸收和利用率。可以对两种酶的基因进行改造或敲除其中一种酶的基因，从而使青霉素生产菌只生产一种产物。2.通过微生物发酵，可以将粮食（如玉米、 小麦等）及各种植物纤维加工成燃料乙醇；将燃料乙醇和普通汽油按一定比例混配，就形成了目前在我国多地广泛使用的乙醇汽油。乙醇汽油的环保性令人称道。调査显示，使用乙醇汽油与使用普通汽油相比，排放到空气中的NO2、 CO等均有不同程度下降。有人认为燃料乙醇“可再生”；但也有人认为，生产燃料乙醇需要消耗大量粮食，会增加粮食短缺的风险。请你尝试通过查阅资料，评估这一风险，并说明在生产时应如何规避这一风险。在生产燃料乙醇时，为了规避这一风险，应该使用陈化粮食（如陈化的稻谷等）或者非粮食生物材料（如秸秆等）。使用陈化粮食来生产燃料乙醇，还有利于防止问题粮食流入市场。复习与提高1.某化工厂为了处理排出污水中的一种有害的、难以降解的有机化合物A，其研究团队用化合物A、磷酸盐、镁盐和微量元素等配制了培养基，成功地筛选出能高效降解化合物A的细菌（目的菌）。实验的主要步骤如下图所示，请分析冋答问题。（1）在培养基中加入化合物A的目的是，这种培养基属于培养基。（2）培养若干天后，应选择培养瓶中化合物A含量的培养液，接入新的培养液中连续培养，使目的菌的数量。筛选出可以降解化合物A的微生物选择显著降低扩增1.（3）若要研究目的菌的生长规律，可挑取单个菌落进行液体培养，再采用方法进行计数。请你预测目的菌的种群数量会发生怎样的变化。（4）将目的菌用于环境保护实践时，还有哪些问题需要解决？（5）有人提出，可以通过改造细菌的基因来获得能够降解化合物A的细菌，请分析这种方法是否可行。细菌计数板计数S形增长目的菌能否在自然环境中大量生长繁殖；是否会产生对环境有害的代谢物；降解化合物A后是否会产生二次污染等问题。可行。这是后面将要学习的基因工程的基本思路。2.某个高温日，某校三位高中学生相约去吃冰激凌，之后两人都出现腹泻现象，于是他们怀疑冰激凌中的大肠杆菌含量超标。老师建议他们利用学过的有关微生物培养的知识对此冰激凌进行检测。经过一番资料查阅，他们提出了如下实验设计思路。立即去卖冰激凌的小店再买一个同样品牌的同种冰激凌；配制伊红—亚甲蓝琼脂培养基（该培养基可用来鉴别大肠杆菌，生长在此培养基上的大肠杆菌菌落呈深紫色，并有金属光泽）、灭菌、倒平板；取10mL刚融化的冰激凌作为原液， 然后进行梯度稀释，稀释倍数为1×10~1×105；取每个浓度的冰激凌液各0.1mL，用涂布平板法进行接种，每个浓度涂3个平板，一共培养18个平板；在适宜温度下培养48h，统计菌落数目。（1）请你从下面几个角度对这三位同学的思路进行评议。2.（1）①他们只打算对一个冰激凌进行检测，理由是：两个人吃过冰激凌后，都拉肚子了，所以再检测一个就足以说明问题。你同意这样的观点吗？为什么？②有没有必要对冰激凌原液进行梯度稀释？为什么？【提示：我国卫生部门规定了饮用水标准，1mL自来水检出的菌落总数不可以超过100个（37℃培养48h），不得检出总大肠杆菌群】不同意。只检测一个冰激凌数据太少，不能排除偶然因素的影响。没有必要。根据国家的标准，自来水中的大肠杆菌数目应该是非常少的。即使冰激凌中大肠杆菌数目超标了，也不可能很离谱，如果进行梯度稀释，最后培养出来的菌落数可能不在计数要求的范围内，从而导致结果误差大。2.③他们认为，在用该方法统计菌落数目时不需要设计对照组，所以只准备培养18个平板。你认为在这项检测中是否需要对照组？为什么？（2） 下图所示为4种菌落分布图，一般不能由涂布平板法得到的是。需要。一组为阴性对照组，不进行涂布或者用无菌水涂布平板，说明培养基是否被污染；另一组为阳性对照组，涂布大肠杆菌。说明该培养基能否培养出大肠杆菌。B2.（3）在完善实验设计思路后，三位同学进行了实验。培养结果显示，除了深紫色菌落，还有其他菌落存在，这说明了什么？如果以菌落数代表样品中的大肠杆菌数量，则统计结果比实际值是偏大还是偏小？为什么？（4）如果实验结果显示，检测的冰激凌中大肠杆菌含量超标了。接下来他们应该做什么？说明冰激凌中不仅有大肠杆菌，还有其他细菌或真菌等。统计结果比实际值偏少。因为有些菌落可能会重叠，统计时容易将其误认为是一个菌落，并且这种计数方法统计的是活菌的数目。应该马上去小店告知店主这批冰激凌不能再卖了；还要告知食品卫生管理部门，以对这批冰激凌的来源进行追踪调查。其他合理答案也可。

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