资源简介

(共78张PPT)
第1章 发酵工程
第2节 微生物的培养技术及应用
微生物：
细菌
原生生物 (草履虫、变形虫、衣藻等)
真菌 (酵母菌、霉菌等)
酵母菌
青霉菌
病毒（无细胞结构）
禽流感病毒
SARS病毒
难以用肉眼观察的微小生物的统称。
——原核生物
——真核生物
——真核生物
草履虫
衣藻
球菌
杆菌
蓝细菌
向经过杀菌处理的牛奶中添加某些对人体有益的细菌，再经过发酵就可以制成酸奶。由于制作工艺并不复杂，一些人会在家里自制酸奶，自制酸奶虽然方便，但是食用自制酸奶导致肠胃不适的事件屡见不鲜，主要原因是制作过程中有杂菌混入。
从社会中来
怎样才能保证无处不在的杂菌不混入发酵物呢？
应该先对制作用具和原料进行灭菌处理，再接种纯的菌种，并控制发酵条件，避免杂菌进入。
在实验室培养微生物：
①为微生物提供合适的营养和环境条件
——培养基
②确保其它微生物无法混入，并将需要的微生物分离出来。
——无菌技术、微生物的纯培养
研究和应用微生物的前提，发酵工程的重要基础：
防止杂菌污染，获得纯净的微生物培养物。
一 微生物的基本培养技术
一、培养基的配制
1.培养基概念：
2.培养基作用：
3.培养基类型：
人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
固体培养基
液体培养基
（分离、计数、鉴定、保藏菌种等）
（扩大培养、工业生产）
培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
是否含凝固剂
（如琼脂）
无
有
划分依据：
物理性质
长有菌落的固体培养基
液体
培养基
保藏
菌种
琼脂是一种从红藻中提取的多糖。
固体培养基中的琼脂仅作为凝固剂，不能为微生物生长提供能量和碳源。
菌落：
单个微生物在琼脂固体培养基上大量繁殖时，在培养基表面或内部形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体。
一个菌落就是一个种群。
不同菌落的形状、大小、颜色等不同，是鉴定菌种的重要依据。
3.培养基类型：
划分依据 培养基种类 特点 用途
化学成分来源
功能用途
含化学成分不明确的天然物质
工业生产
培养基成分明确
分类、鉴定
允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基
培养、分离出特定微生物
在培养基中加入某种指示剂或化学药品，用以鉴别不同种类的微生物
鉴别不同种类微生物
天然培养基
合成培养基
选择培养基
鉴别培养基
【注意】病毒为非细胞结构生物，只能在活细胞中营寄生生活，目前不能
利用人工培养基来培养。
一、培养基的配制
1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的营养组成
组分 含量 提供的主要营养
牛肉膏 5g 碳源、磷酸盐和维生素等
蛋白胨 10g 氮源和维生素等
NaCl 5g 无机盐
H2O 定容至1000ml 水
一般都含有水、碳源、氮源、无机盐等。
4.培养基的营养构成：（1）基本成分
牛肉膏是采用新鲜牛肉经过消化、过滤、浓缩而得到的一种棕黄色至棕褐色的膏状物。
淡黄色粉剂，一般用于蛋白胨生产的蛋白包括动物蛋白（肉类）和植物蛋白（豆类）等两种。
来源于动物，含有糖、维生素和有机氮等营养物质。
牛肉膏、蛋白胨：
碳源
无机碳源：
有机碳源：
氮源
NH4＋、NO3-、NH3等。
牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等
CO2、CO32-、HCO3-
葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等
无机氮源：
有机氮源：
无机盐
Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo等
大量元素：
微量元素：
K、 Ca、Mg等
——自养微生物
——异养微生物
一、培养基的配制
4.培养基的营养构成：（1）基本成分
水
培养基不一定都含有碳源、氮源，如培养自养型微生物的培养基中不需加入碳源，分离自生固氮菌的培养基中，不需加入氮源。
【思考】
1.为什么培养基需要氮源？
2.微生物培养基是否都需要人工添加碳源或氮源？
微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需。
（2）特殊需求：
满足微生物对 的需求
④培养厌氧微生物时，需要提供_____的条件。
①培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加_______；
②培养霉菌时，需要将培养基调至_____；
③培养细菌时，需要将培养基调至____________；
维生素
酸性
中性或弱碱性
无氧
pH、特殊营养物质、氧气
一、培养基的配制
4.培养基的营养构成：
缓冲剂：
常用磷酸氢二钾（K2HPO4，碱性）或磷酸二氢钾（KH2PO4，酸性）。
如生长因子：必不可少，需求量少。（某些氨基酸、
碱基、维生素等）
二、无菌技术
获得纯净的微生物培养物的关键是 ，
主要包括 和 。
防止杂菌污染
消毒
灭菌
无菌技术除用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么作用？
还能有效避免操作者被微生物感染。
二、无菌技术
1.消毒
（1）概念
（2）消毒方法
使用较为 的物理、化学或生物等方法杀死物体 或内部
微生物。
温和
表面
一部分
①煮沸消毒法：
a.操作：
b.应用范围：
100℃煮沸5~6min
家庭餐具等生活用品
二、无菌技术
1.消毒
（2）消毒方法
②巴氏消毒法：
a.操作：
b.应用范围：
不耐高温的液体
62~65℃下煮30min或80~90℃下煮30s~1min
③化学药剂消毒法：
a.操作：
b.应用范围：
酒精擦拭双手；氯气消毒水源
皮肤、伤口、动植物组织表面消毒、空气、手术器械、塑料或玻璃器皿
杀死绝大多数微生物，并且不破坏营养成分
二、无菌技术
1.消毒
（2）消毒方法
④紫外线消毒法：
a.操作：
b.应用范围：
接种室、接种箱或超净工作台
紫外线照射30min（损伤细菌的DNA）
⑤生物消毒法：
a.操作：
b.应用范围：
利用微生物或其代谢物除去环境中的部分微生物。
有的微生物能够寄生于多种细菌体内，使细菌裂解，因此可以用它们来净化污水、污泥。
对象：操作的空间、
操作者的衣着和手
2.灭菌
使用 的理化方法杀死物体内外 的微生物，包括芽孢和孢子。
强烈
所有
二、无菌技术
芽孢
细菌休眠体。
芽孢壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。
孢子
细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖作用的无性生殖细胞。能直接发育成新个体。
二、无菌技术
①湿热灭菌：
a.操作：
b.原理：
c.应用范围：
2.灭菌
高压蒸汽灭菌锅
高压蒸汽灭菌锅内100kPa、121 ℃下维持15~30min（效果最好）
破坏蛋白质、核酸等结构使其变性
培养基
注：使用后的培养基必须灭菌后才能丢弃，以免污染环境。
二、无菌技术
②干热灭菌：
a.操作：
b.原理：
c.应用范围：
2.灭菌
干热灭菌箱内160~170 ℃下加热2-3h
使微生物细胞膜破坏、蛋白质变性和原生质干燥等
耐高温，需保持干燥的物品：
玻璃器皿（如试管、培养皿、吸管、注射器）
金属器具（如针头、 镊子等）
二、无菌技术
③灼烧灭菌：
a.操作：
b.应用范围：
2.灭菌
直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧
接种工具，如：涂布器、接种环、接种针或其他金属工具
接种过程中，试管口、瓶口等容易被污染的部位
对象：微生物培养的器皿、接种工具、培养基
现学现用
1.下列物品所采用的灭菌或消毒方法依次是
培养基
培养皿
接种环
实验操作者的双手
实验室
牛奶
湿热灭菌（高压蒸汽灭菌）
干热灭菌
灼烧灭菌
化学药剂消毒
紫外线消毒
巴氏消毒法
2.无菌技术的具体内容：
（1）对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和 。
（2）将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行 。
（3）实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与 接触。
（4）为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在 并在 附近进行。
现学现用
消毒
灭菌
周围的物品
酒精灯火焰
超净工作台上
由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。
1.概念：
2.原理：
在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体，成为培养物。
三、微生物的纯培养
微生物群
分散或稀释
单个细胞
单个菌落
繁殖
3.步骤：
①配制培养基；②灭菌；③接种；④分离；⑤培养
平板划线法或稀释涂布平板法
固体培养基
四、探究·实践：酵母菌的纯培养
实验步骤1：制备培养基
计算→称量→溶化→定容
（马铃薯琼脂培养基）
培养基：
培养皿：
将配制好的培养基，转移到锥形瓶中。
待培养基冷却至50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。
配制培养基
灭菌
倒平板
湿热灭菌（高压蒸汽灭菌）
干热灭菌
四、探究·实践：酵母菌的纯培养
实验步骤1：制备培养基
（马铃薯琼脂培养基）
①防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染；②防止水分过快蒸发。
倒平板：
配制培养基的注意事项：
定容后，灭菌前
①培养基pH要适宜
（灭菌前/灭菌后）调pH
②培养基灭菌后要冷却到50℃左右时开始倒平板。其原因是？
倒平板时高于50℃会烫手；
低于50℃时，若不及时操作，琼脂会凝固（44℃以下凝固）。
用手触摸锥形瓶，感觉温度下降到刚刚不烫手时，就可以倒平板。
③你用什么办法来估计培养基的温度？
配制培养基的注意事项：
④在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
最好不要。
防止空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
将所倒平板放入37℃的恒温箱中培养24h~48h，观察是否有菌落存在。
⑤怎么确定所倒平板未被杂菌污染？
四、探究·实践：酵母菌的纯培养
实验步骤2：接种和分离酵母菌
接种环
微生物群
分散或稀释
单个细胞
单个菌落
繁殖
梯度稀释→涂布平板
从上一次划线的末端开始划线，最后一次划线与第一次的划线不能相连。
平板划线法
稀释涂布平板法
1
灼烧接种环
试管口灭菌
5
冷却接种环；
拔出培养液试管棉塞
2
试管口灭菌
3
蘸取菌液
4
皿盖打开，划线
6
灼烧接种环，划线
7
【问题探究1】为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？
在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
灼烧时期 目的
取菌种前
每次划线前
接种结束后
杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞
杀死接种环上原有微生物
接种环共需灼烧几次？
6次
四、探究·实践：酵母菌的纯培养
【问题探究2】在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？
【问题探究3】在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次
划线的末端开始划线？
【问题探究4】为什么最后一次划线与第一次的划线不能相连？
避免接种环温度太高，杀死菌种。
划线后，线条末端酵母菌的数目比线条起始处要 ，每次从上一次划线的末端开始，能使酵母菌的数目随着划线次数的增加而逐步 ，最终能得到由 细胞繁殖而来的 。
最后一次划线已经将细菌稀释成 的细胞，如果与第一次划线相连则增加了细菌的数目，达不到纯化的效果。
单个
少
减少
单个
菌落
接种和分离酵母菌：
找出防止杂菌污染的操作
【归纳总结】平板划线法接种菌种时，可防止杂菌污染的操作：
①划线操作在酒精灯火焰旁进行。
②接种前将接种环放在酒精灯火焰上灼烧。
③接种环蘸取菌液前后，要将试管口通过火焰。
④划线时将培养皿的皿盖打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划线，划线后及时盖上皿盖。
①接种环蘸 次菌液，但要在培养基不同位置连续划线多次；
②每次划线都是从 开始划线；
③最后一次划线 与第一次划线相连；
④ 接种环要进行灭菌。
平板划线法注意事项：
四、探究·实践：酵母菌的纯培养
实验步骤2：接种和分离酵母菌
取菌种前、每次划线前、接种结束后
一
上一次划线的末端
不能
四、探究·实践：酵母菌的纯培养
实验步骤3：培养酵母菌
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板 ，放入 左右（培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异）的恒温培养箱中培养24~48h。
倒置
28℃
作对照，该培养皿无菌落说明培养基没有污染
警示：在实验室中，切记不可吃东西、喝水；离开实验室时一定要洗手，以防止被微生物感染。使用后的培养基在丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境。
1.未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有，说明了什么？
2.在接种酵母菌的培养基上，你是否观察到了菌落？这些菌落的颜色、形状、大小是否一致？如果你观察到了不同形态的菌落，你能分析可能是哪些原因引起的吗？
没有。 如果有，说明培养基被杂菌污染。
原因：接种的菌种不纯、无菌操作不规范。
四、探究·实践：酵母菌的纯培养
现学现用
1.下列关于培养基的叙述，正确的是（ ）
A. 在配制培养基时，除满足营养需求外，还应考虑pH、O2及特殊营养物质的需求
B. 碳源和氮源必须具有一定比例，碳元素的含量最多，其次为氮元素
C. 可利用液体培养基上菌落的特征来判断和鉴别细菌的类型
D. 每种微生物在培养时，培养基中都需要有水、碳源、氮源、无机盐
E. 感染杂菌的培养基和使用过的培养基都必须经灭菌处理后才能丢弃
F. 配制培养基时，溶化后分装前，必须要进行的是调整pH和灭菌
G. 微生物平板培养需倒置平板，目的是防止冷凝水珠污染培养基
H. 倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上
AEFG
2.在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。回答下列问题：
（1）在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具 （填“可以”或“不可以”）放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。
（2）牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法。与煮沸消毒法相比，两种方法的优点是 。
（3）密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能
，在照射前适量喷洒 ，可强化消毒效果。
（4）水厂供应的自来水通常是经过 （填“氯气”、“乙醇”或“高锰酸钾”）消毒的。
（5）某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是 。
在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少
可以
破坏DNA
消毒液
氯气
未将锅内冷空气排尽
“水果酵素”的功效是否真实？
所谓“酵素”，就是“酶”的另一种说法。“酵素”制作就是利用微生物进行无氧呼吸的原理，进行像制作泡菜一样的发酵。这样制作的“酵素”中可能有糖类（包括一些简单的糖和膳食纤维等）、蛋白质（包括多种酶）、有机酸等成分，不存在它独有的、特殊的营养物质，其中甚至可能含有微生物发酵产生的有毒物质，食用后可能会危害人体健康。因此，“吃水果‘酵素’可以美容、减肥、促进消化和提高免疫力”的论点值得怀疑。
思维训练：评估论点的可信程度
一、概念检测
1.微生物的纯培养既需要适宜的培养基，又要防止杂菌污染。判断下列相关表述是否正确。
（1）培养基中的营养物质浓度越高，对微生物的生长越有利。（ ）
（2）消毒和灭菌的杀菌程度存在差异。（ ）
（3）微生物的纯培养物就是不含有代谢废物的微生物培养物。（ ）
2. 日常生活中保存食品的方法有哪些？这些方法是如何阻止或抑制微生物生长的？
×
×
√
干制
腌制
低温储存
——降低食品的水分含量；
——通过食盐、糖等制造高渗环境，从而抑制微生物的生长和繁殖；
——通过降低微生物的代谢速率来抑制微生物的生长和繁殖。
1.某同学将5个手指尖在贴有“洗手前”标签的培养基上轻轻按一下。然后用肥皂将该手洗干净，再将5个指尖在贴有“洗手后”标签的同种培养基上轻轻按一下。将这两个培养皿放入37℃恒温培养箱中培养24h后，发现贴有“洗手后”标签的培养皿中菌落较少。请分析冋答下列问题。
（1）这个实验中需要进行灭菌处理的材料用具有 。
（2）“将指尖在培养基上轻轻按一下”相当于微生物培养中的哪一步操作？
（3）从实验结果来看，洗手后我们就能进行无菌操作了吗？操作时，我们可以采用什么方法来避免手上微生物的污染？
培养皿和培养基
接种。
通过实验结果可以看到，洗手后手上还有一些微生物，不能直接进行无菌操作。可以通过用酒精棉球擦拭双手，或戴消过毒的手套等方法来避免手上微生物的污染。
2.某生物兴趣小组将从葡萄皮上成功分离来的野生酵母菌分别接种于3个盛有等量同种液体培养基的锥形瓶中，并放置在摇床上培养，摇床转速分别为210r/min、230r/min和250r/min。培养时间与酵母菌种群密度的关系如下图所示。请分析回答下列问题。
（1）摇床转速不同，意味着培养条件有什么不同？
（2）从图中数据你可以得出什么结论？
其原因是什么？
（3）为什么培养8h后，其中2个锥形瓶中
酵母菌的种群密度基本达到稳定？
O2含量不同。
培养液中O2含量越高，
酵母菌种群密度越大。
已经达到了环境容纳量。
二 微生物的选择培养和计数
美国黄石国家公园
如何从众多的微生物中筛选出单一菌种？
水生栖热菌能在70~80℃高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
启示：寻找目的菌时，要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
1973年，布鲁克从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌，从这种菌中提取出耐高温的DNA聚合酶。
为什么水生栖热菌能从热泉中被筛选出来呢？
思路：人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物的生长。
科学实例：寻找耐高温的DNA聚合酶
一、选择培养基
类型 条件 分离得到的菌种
改变培养条件 70～80℃的高温
添加某种化学物质 加入青霉素
高浓度食盐
特殊碳、氮源 石油是唯一碳源
营养缺陷 不加碳源
不加氮源
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。
水生栖热菌
酵母菌、霉菌等真菌
金黄色葡萄球菌
能消除石油污染的微生物
自养型微生物
固氮菌
尿素［CO（NH2）2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。
讨论：
1.如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？
2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
设计一种选择培养基，尿素作为唯一氮源。
区别：只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分基本相同。
（细菌生长的氮源）
尿素 NH3
脲酶
尿素分解菌
思考·讨论：选择培养基配方的设计
左边两种培养基有哪些共同点和不同点？
①从物理性质来讲，两者属于 培养基；
②从用途上来讲，培养基二属于 培养基，目的是为了获得 ；
③两种培养基共有的培养基成分有：
；
培养基一的碳源主要为 ，
氮源主要为 ；
培养基二的碳源主要为 ，
氮源为 。
固体
选择
能分解尿素的微生物
碳源、氮源、无机盐、水
牛肉膏
蛋白胨
葡萄糖
尿素
牛肉膏 5.0g
蛋白胨 10.0g
NaCl 5.0g
琼脂 20.0g
蒸馏水 定容到1000ml
KH2PO4 1.4g
NaH2PO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素CO（NH2）2 1.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 定容1000ml
培养基一
培养基二
编号 ① ② ③ ④ ⑤
成分 （NH4）2SO4 KH2PO4 FeSO4 CaCl2 H2O
含量 0.4 g 4.0 g 0.5 g 0.5 g 100 mL
据某微生物培养基的配方表回答下列问题：
1.此培养基按物理性质划分属于 培养基，理由是 ；
按功能划分属于 培养基，因为没有碳源，只有 微生物才能生长（利用空气中的CO2）。
2.此培养基含有的微生物的营养成分包括 三类，若加入氨基酸，则它可充当的营养成分包括 。
3.若要观察微生物的菌落特征，培养基中应添加的成分是 。
4.若用该培养基来分离尿素分解菌，应除去表中 成分（填表中序号），应加入 和 的有机物。
液体
选择
自养型
水、无机盐、氮源
碳源、氮源、生长因子
凝固剂（琼脂）
①
尿素
不含氮元素
没有凝固剂（琼脂）
二、微生物的选择培养
【问题】1g土壤中有多少能分解尿素的细菌？
1.原理
分离：获得能分解尿素的细菌的纯培养物
计数：测定分解尿素的细菌的数量
——稀释涂布平板法
梯度稀释→涂布平板
×
以尿素作为唯一氮源的选择培养基
培养基类型：
方法：
6支试管，分别加入9ml无菌水
1ml
102
1ml
103
1ml
104
1ml
105
1ml
106
1ml
107
稀释10倍菌液
101
土样10g
①铲取土样，将样品装入纸袋中
注：取土样用的小铁铲和盛土样的的纸袋在使用前都要灭菌。
②在火焰旁称取土壤10g，加入90ml无菌水中，充分摇匀。
二、微生物的选择培养
2.流程：梯度稀释
③取0.1ml菌液，滴加到培养基表面。
④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使菌液涂布均匀。
过多会导致菌液在培养基表面形成积液，导致菌体堆积，影响分离效果。
移液枪
二、微生物的选择培养
2.流程：涂布平板
恒温培养箱
稀释104倍
稀释105倍
稀释106倍
空白对照
细菌一般选用104、105、106 稀释倍数的菌液进行平板培养。
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30-37℃的恒温培养箱中，培养1-2d。
二、微生物的选择培养
2.流程：菌落培养
方法 平板划线法 稀释涂布平板法
纯化原理
接种工具
单菌落的获得
用途
效果图
相同点
连续划线
梯度稀释→涂布平板
接种环
涂布器
从最后划线区挑取
稀释度合适的整个平板上都可找到单菌落
分离纯化菌种，
获得单菌落
①分离纯化菌种，获得单菌落
②用于计数
①都能分离纯化菌种；②都在固体培养基上进行
三、微生物的数量测定
计数方法：
①稀释涂布平板法
②显微镜直接计数法
——间接计数法
——直接计数法
稀释涂布平板法
②显微镜直接计数法
①比浊法
三、微生物的数量测定
（1）间接计数法：
（2）直接计数法：
1.计数方法：稀释涂布平板法
三、微生物的数量测定
（1）计数原理
当样品的稀释度足够高时，
一个单菌落来源于样品稀释液中的一个活菌，
统计菌落数，可推测出活菌数。
①一般选择菌落数为 的平板
进行计数。
②样品的稀释度将直接影响平板上的菌落数目，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养。
③在同一稀释度下，应至少对 个平板进行重复计数，然后求出
。
3
平均值
重复实验，减少误差
三、微生物的数量测定
1.计数方法：稀释涂布平板法
（2）计数原则
30~300
【例】甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、
90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离
尿素的细菌数目？
（80+90+100）/3
0.1
× 105
= 9×107个
【问题探究2】4号试管的结果表明每克土壤中的活菌数约为多少个？
1.1×108
三、微生物的数量测定
1.计数方法：稀释涂布平板法
（3）计算公式
（4）计数结果分析
①统计的菌落数往往比活菌的实际数目 ；
因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是 菌落。
②统计结果一般用 而不是用活菌数来表示。
少
菌落数
一个
每克样品中的菌株数＝
×稀释倍数
土壤是微生物的天然培养基，下面是有关土壤中分解尿素的细菌的分离和计数的实验过程，请根据下图回答相关问题。
（1）为分离出土壤中分解尿素的细菌，应该用　　　 　　　　　的选择培养基进行分离。
（2）若取土样5 g，应加入　　　 　 中配制成1×101倍稀释的土壤溶液。因土壤中细菌密度很大，需要不断加以稀释，配制成如上图所示的不同浓度的土壤溶液。取样稀释前，一定要　　　　　 　　　以减少误差。
稀释倍数 1×103 1×104 1×105 1×106 1×107
平均菌落数 >500 367 248 26 18
以尿素为唯一氮源
45 mL无菌水
摇匀（振荡、混匀）
（3）从1×103~107倍稀释的稀释液中分别吸取0.1mL加到固体培养基上，用　　 将其分散，每个浓度稀释液至少接种　　个平板，以减少实验误差。
（4）将接种的培养皿　　　　在30-37℃的　　　 箱中培养1-2 d，观察并统计　 ，结果如上表所示。找出合适浓度，推测出每克土样中的菌落数为　 。
稀释倍数 1×103 1×104 1×105 1×106 1×107
平均菌落数 >500 367 248 26 18
3
倒置
恒温培养
菌落数
2.48×108
涂布器
三、微生物的数量测定
2.计数方法：比浊法
分光光度计
将未知细胞数的菌悬液的光密度与已知细胞数的相比
菌悬液中的细胞浓度与光密度成正比
在一定波长下，测定菌悬液的光密度
缺点：不能区分死菌和活菌
（1）类型：
（2）优点：
（3）缺点：
三、微生物的数量测定
血细胞计数板：
细菌计数板：
①不能区分死菌和活菌→偏大；
②不适于对运动细菌的计数；
③个体小的细菌在显微镜下难以观察。
快速、直观
常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数
对细菌等较小的细胞进行观察和计数
3.计数方法：显微镜直接计数法
某生物实验小组将酵母菌接种到装有10mL液体培养基的试管中，通气培养并定时取样计数，然后绘制增长曲线。图1是小组成员用血细胞计数板观察到的培养结果（样液稀释10倍，血细胞计数板规格1mm×1mm×0.lmm），图2曲线a、b是两批次酵母菌培养的结果。分析回答问题。
（2）在计数前常采用台盼蓝染液染色，若细
胞被染成蓝色，则_________（选填“需要”
或“不需要”）计数。计数时若图1双线边内
有4个细胞为蓝色，此时试管中酵母菌数量约
为_________个。
不需要
5×108
探究·实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
1.提出问题
2.做出假设
3.实验思路
土壤中含有能分解尿素的细菌，我们如何分离它们？
每克土壤样品究竟含有多少这样的细菌？
利用以“尿素作为唯一碳源”的选择培养基，可以分离。
自变量：________________________________
因变量：________________________________
无关变量：______________________________
尿素
能分解尿素细菌的生长情况
培养时间、培养基的pH、温度等
微生物的培养与观察
土壤取样
制备培养基
样品稀释
与取样涂布
①提供无机盐
②调节pH
制备选择培养基（尿素为唯一氮源）
制备牛肉膏蛋白胨培养基
思考：为什么还要制备牛肉膏蛋白胨培养基？
①碳源
②提供能量
探究·实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
4.进行实验
①培养基的制备
对照作用，判断选择培养基是否具有选择作用
②土壤取样
③样品的稀释与涂布平板
探究·实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
4.进行实验
A 取样地：酸碱度接近中性的潮湿土壤中。
B 取 样：铲去表层土（一般3cm左右）。
细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。
测土壤细菌数：一般用104、105、106稀释液。
测土壤酵母菌数：一般用102、103、104稀释液。
不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300、适于计数的平板。
探究·实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
4.进行实验
a.每个浓度设置了 个平板，1、2、3平板是选择培养基（ 实验），4为 培养基；
b.另外，整个实验还要设置 个空白对照平板：未接种的
。
培养基，以验证培养基中是否含有杂菌。
4
重复
牛肉膏蛋白胨
2
选择培养基和牛肉膏蛋白胨
③样品的稀释与涂布平板
培养条件：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d。
观察：每隔 统计一次菌落数目，选取 时的记录作为结果，防止 。
结果：一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。
因培养时间不足而导致菌落数目遗漏
24h
菌落数目稳定
探究·实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
4.进行实验
④微生物的培养与观察
培养基未被杂菌污染
培养基被杂菌污染
选择培养基具有选择作用
探究·实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
5.实验结果分析
现象 分析
未涂布培养基上无菌落生长
未涂布培养基上有菌落生长
牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目明显多于选择培养基上的菌落数目
探究·实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
6.进一步探究
本活动只是初步筛选了能分解尿素的细菌，对分离的菌种进行鉴定还需要借助生物化学的方法。
CO（NH2）2+H2O
脲酶
2NH3+CO2
方法：在培养基中加入酚红指示剂
——鉴别培养基
呈碱性，遇酚红指示剂呈红色。
①液体培养基：直接看液体的变色情况；
②固体培养基：观察菌落周围是否出现红色环带。
一、概念检测
1.研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌，判断下列相关表述是否正确。
（1）这种培养基是一种选择培养基。（ ）
（2）利用这种石油降解菌可以降解石油，修复土壤。（ ）
（3）相对于未被污染的土壤，从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌。（ ）
√
√
√
一、概念检测
2.用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数，原因是（ ）
A. 菌落中的细菌数目是固定的
B. 平板上的一个菌落就是一个细菌
C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同
D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌
D
二、拓展应用
1.反刍动物，如牛和羊，具有特殊的器官——瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设计一个实验，从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。
提示：反刍动物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡。
①用“尿素为唯一氮源”的选择培养基进行培养；
②创造无氧环境进行培养。
二、拓展应用
2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中40%～ 60%能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用秸秆等生产酒精，
用纤维素酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，
它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，
但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反
应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，
刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维素被纤
维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中
会出现以这些菌为中心的透明圈（如下图所示）。
请回答下列问题。
二、拓展应用
2.（1）现在要从土壤中分离纤维素分解菌，请你给出详细的实验方案。
（2）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？
（3）有同学说，可以把滤纸埋在土壤中，经过一段
时间后，再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。
请你评价这一做法。
纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中，
采集土样时，可以选择纤维素丰富的环境，如树林
中多年落叶形成的腐殖土等。
这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境，腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。

展开更多......

收起↑