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(共84张PPT)
微生物 代谢类型 生物分类 发酵产品 分布 温度 对氧的需求
乳酸菌
酵母菌
醋酸菌
异养厌氧型
C6H12O6 2C3H6O3(乳酸)+能量
酶
乳制品的发酵、
泡菜的制作
异养兼性厌氧型
C6H12O6 2C2H5OH+2CO2+能量
酶
酿酒、制作馒头和面包等
异养需氧型
C6H12O6＋2O2 2CH3COOH＋2CO2＋2H2O
酶
酶
C2H5OH ＋ O2
CH3COOH ＋ H2O
可用于制作各种风味的醋
细菌
原核生物
真菌
原核生物
细菌
原核生物
空气、土壤、植物体表、人或动物的肠道内
30-35℃
28℃
18-20℃
前期需氧，
后期不需氧
一直需氧
密闭不需氧
发酵微生物及特点
含糖量较高的水果、蔬菜表面
空气中
微生物的发酵反应式
泡菜制作：
果酒制作：
果醋制作：
C6H12O6 2C2H5OH(酒精)+2CO2+能量
酶
微生物的基本培养技术及应用
第2节
第一章 发酵工程
第1课时
微生物的基本培养技术
SW-PWF
向经过杀菌处理的牛奶中添加某些对人体有益的细菌，再经过发酵就可以形成酸奶。由于制作工艺并不复杂，一些人会在家里自制酸奶。自制酸奶虽然方便，但是由于自制酸奶造成肠胃不适的事屡见不鲜，主要原因是在制作过程中有杂菌混入。那么怎样才能保证无处不在的杂菌不混入发酵物呢？
从社会中来
应该先对制作用具和原料进行灭菌处理，再接种纯的菌种，并控制发酵条件，避免杂菌进入。
这需要应用无菌技术和微生物的培养技术 。
酸奶
相关信息＝ ＝＝＝＝＝＝＝＝
微生物
1.概念：
难以用肉眼观察的微小生物的统称。
光学显微镜可见细胞(μm)；
电子显微镜可见细胞器、病毒(nm)
SARS病毒、新冠病毒等RAN病毒；噬菌体等DNA病毒
个体微小、结构简单
◆微生物的共同特点：
1. 是研究和应用微生物的前提，也是发酵工程的重要基础。
2.实验室培养微生物的条件：
①为微生物提供合适的 条件；
②要确保 ，并将需要的微生物分离出来。
防止杂菌污染，获得纯净的微生物培养物
微生物结构简单、形体微小，眼睛看不到，若想得到纯净的微生物，就必须对其进行培养和分离。
营养和环境
其他微生物无法混入
培养基
无菌技术
一、培养基的配置
1.培养基的概念:
3.培养基的类型：
固体培养基
液体培养基
加入凝固剂(如琼脂)
2.培养基的作用:
人们按照微生物对 的不同需求，配制出供其_________的营养基质。
营养物质
生长繁殖
用以 微生物或 。
积累其代谢物
不含凝固剂(如琼脂)，呈液态状态
注：琼脂仅作为凝固剂不为微生物生长提供能量和碳源
琼脂固体培养基，是实验室中最常用的培养基之一
培养、分离、鉴定、保存
分离、计数、
鉴定等
扩大培养、
工业生产
①按照物理性质分：
微生物在固体培养基表面或内部生长，可以形成肉眼可见的菌落
菌落:是指由单个微生物细胞在适宜固体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度，形成以母细胞为中心的一团肉眼可见的、有一定形态、构造等特征的子细胞集团。
念珠菌
霉菌
酵母菌
放线菌
菌落是鉴定菌种的重要依据
形状、大小、光泽度、颜色、透明度等。
微生物生长繁殖产生的菌落
沙门氏菌
毛霉
一、培养基的配置
3.培养基的种类
②按化学成分分：
天然培养基
合成培养基
用化学成分不明确的天然物质配成，如加入血清血浆等
根据细胞生存所需要的种类和数量用人工方法模拟合成
③按用途分：
选择培养基
鉴别培养基
基础培养基
在培养基中加入（或缺少）某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长。
根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成，用以鉴别不同种类的微生物。
含有一般微生物生长繁殖所需要的基本营养物质（牛肉膏蛋白胨培养基）
划分 培养基种类 特点 用途
物理 性质
化学 成分
用途
不加凝固剂
加凝固剂，如琼脂
工业生产
观察微生物的运动、分类鉴定
微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种
含化学成分不明确的天然物质
工业生产
培养基成分明确
分类、鉴定
在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长
培养、分离出特定微生物
在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物
鉴别不同种类微生物
选择培养基
液体培养基
半固体培养基
固体培养基
天然培养基
合成培养基
鉴别培养基
补充资料：培养基的类型及用途
(1)主要营养物质：一般都含有 等营养物质。
水、碳源、氮源、无机盐
4.培养基的营养构成：
成分 含义 来源 功能
碳源 提供碳元素的物质 无机碳源：CO2、CO32-、HCO3-等含碳无机物 ①构成细胞物质和一些代谢产物；
②有机碳既是碳源又是能源
有机碳源：糖类、脂质、蛋白质、有机酸、石油、牛肉膏和蛋白胨等
氮源 提供氮元素的物质 无机氮源：N2、NH3，氨盐、硝酸盐等 将无机氮合成含氮的代谢产物
有机氮源：牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等 合成蛋白质、核酸和含氮的代谢废物
水 生物体内含量最多的化合物 外界摄入(培养基、代谢产物) ①良好的溶剂，参与化学反应；
②维持生物大分子结构的稳定
无机盐 提供除碳、氮以外的元素，包括大量元素和微量元素 无机化合物： ①提供无机营养；
②调节培养基的pH；
③维持渗透压
牛肉膏、蛋白胨来源于动物，含有糖、维生素和有机氮等营养物质
自养微生物
异养微生物
组分 含量 提供的主要营养
牛肉膏 5g 等
蛋白胨 10g 等
琼脂 20g 凝固剂
NaCl 5g 无机盐
H2O 定容至1000ml 水
某种常见的细菌培养基——牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成
表1-1 1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的营养组成
(1)根据培养基的物理性质，该培养基属于哪类培养基，理由是什么？
固体培养基；该培养基的配方中含有凝固剂琼脂。
(2)该培养基中主要提供碳源和氮源的物质分别是什么？属于有机物还是无机物？
主要提供碳源的牛肉膏，主要提供氮源的蛋白胨。二者均属于有机物。
(3)该培养基培养的微生物同化作用类型是什么？理由是什么？
异养型微生物。该微生物的碳源和氮源是有机物。
碳源、氮源、 磷酸盐和维生素
碳源、氮源和维生素
1.为什么培养基需要氮源？
是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的。
2.培养微生物时，培养基中是否必须有碳源和氮源？
不一定。例如，培养自养型微生物时，一般不需要添加碳源，微生物可以利用空气中的二氧化碳；培养固氮微生物时，一般不需要添加氮源，微生物可以利用空气中的氮气。
根据碳/氮源的种类判断微生物同化作用是自养还是异养
a.异养型微生物的碳源为
b.自养型微生物的碳源为
含碳有机物
含碳无机物
旁栏思考：
3.几种微生物的营养和能量来源
微生物 碳源 氮源 能源
蓝细菌 CO2 光能
硝化细菌 CO2 NH3 NH3的氧化
根瘤菌 糖类等有机物 N2 有机物
大肠杆菌 糖类、蛋白质等有机物 蛋白质等 有机物
自养
微生物
异养
微生物
例：下表是某微生物培养基的成分，请分析该培养基可用来培养哪种微生物？若除去①，此培养基可用来培养圆褐固氮菌吗？
编号 ① ② ③ ④ ⑤
成分 (NH4)2SO4 KH2PO4 FeSO4 CaCl2 H2O
含量 0.4 g 4.0 g 0.5 g 0.5 g 100 mL
圆褐固氮菌虽可以固氮，但其同化作用类型为异养型，培养基中必须提供有机碳源，所以该培养基不能用来培养圆褐固氮菌。
此培养基可用来培养自养型微生物。
(2)其他需求：还需要满足微生物生长对 的需求。
pH、特殊营养物质、O2
例如：
特殊营养物质：主要指生长因子(微生物生长所必须的、微量的、自身不能合成或合成很少的有机物)
种类：维生素、氨基酸、碱基、嘌呤、嘧啶、胺类等
来源：酵母膏、蛋白胨、动植物组织提取液等
④培养厌氧微生物时，需要提供 的条件。
①培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加 ；
②培养霉菌时，需要将培养基调至 ；
③培养细菌时，需要将培养基调至 ；
维生素
酸性
中性或弱碱性
无氧
4.培养基的成分：
二、无菌技术
获得纯净的微生物培养物的关键是 。无菌技术主要
包括 。
防止杂菌污染
消毒和灭菌
(1)对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行 。
(2)将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行 。
注意事项：
实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品 。
为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在
。
清洁和消毒
灭菌
超净工作台上并在酒精灯火焰附近进行
相接触
1.消毒和灭菌工作主要包括两方面：
二、无菌技术
比较项目 消毒 灭菌
概念 使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物 使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子
作用强度 较为温和的理化因素 强烈的物理、化学因素
作用程度 杀死物体表面或内部的部分微生物 杀死物体内外所有的微生物
芽孢和孢子 消灭部分芽孢 能杀灭全部芽孢和孢子
适用对象 操作空间、活体生物材料、操作者的衣着和双手 操作工具、玻璃器皿、培养基等
常用方法 煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒法 湿热灭菌法、灼烧灭菌法、干热灭菌法
消毒和灭菌的原理都是使微生物的蛋白质变性，借此杀死微生物。但两者的实质不同。消毒的结果实际上是部分灭菌。
2.消毒与灭菌的概念及区别：
知识拓展
芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢煮沸3小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜(如温度、水分适宜)的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌。
孢子：细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖作用的无性生殖细胞。能直接发育成新个体。
芽 孢 和 孢 子
芽孢：有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体(不是繁殖体)，叫作芽孢。
3.资料卡——常用的消毒与灭菌的方法
(1)消毒的主要方法及应用范围
方法 适用范围 操作方法
煮沸消毒法
巴氏消毒法
化学药剂消毒法
紫外线消毒
日常生活用品(家庭餐具)
100℃煮沸5～6 min，可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢。
不耐高温的液体(牛奶、啤酒、果酒和酱油等)
62～65 ℃消毒30 min或80～90 ℃处理30 s～1 min,可以杀死绝大多数微生物，不破坏营养成分
生物活体(皮肤、伤口、动植物组织表面消毒)、水源、手术器械、塑料或玻璃器皿等
体积分数为70%-75%的酒精擦拭双手、用氯气消毒水源，碘酒皮肤伤口，石炭酸等
房间、仪器设备(接种箱、接种室、超净工作台)
紫外线照射30 min
相关信息：生物消毒法
3.资料卡——常用的消毒与灭菌的方法
(2)灭菌的主要方法及应用范围
方法 适用范围 操作方法
湿热灭菌
干热灭菌
灼烧灭菌
高压蒸汽灭菌锅:压力100kPa、温度121℃下维持15-30min
培养基、无菌水等多种器材
物品放入干热灭菌箱，160～170℃的热空气中维持2～3 h
耐高温、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿(如吸管、培养皿)、金属用具 (如针头、 镊子、剪刀等)等
直接在酒精灯火焰的充分燃烧层(外焰)灼烧，可以迅速彻底地灭菌。
适用于微生物的接种工具，如涂布器、接种环、接种针或其它金属用具，试管口、瓶口等容易被污染的部位
高压蒸汽灭菌锅
干热灭菌箱
1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？
2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。
(1)培养细菌用的培养基与培养皿
(2)玻棒、试管、烧瓶和吸管
(3)实验操作者的双手
无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。
旁栏思考：
(1)、(2)需要灭菌；(3)需要消毒。
培养基用高压蒸汽灭菌，
培养皿、玻璃棒、试管、烧瓶、吸管可以采用干热灭菌法，实验操作者的双手可以用酒精擦拭。
目的：①防止培养物被污染；②防止感染实验操作者。
1.相关概念
2.微生物纯培养的步骤
(1)培养物：
(2)纯培养物：
(3)纯培养：
获得 的过程。
配制培养基
灭菌
接种
分离
培养等
三、微生物的纯培养
在微生物学中，将接种于 内，在合适条件下形成的含 的群体。
由 所获得的微生物群体。
纯培养物
培养基
特定种类微生物
单一个体繁殖
(1)菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。
(2)单菌落：一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。
（3）特征：
（4）功能：
(4)获得单菌落的方法：
1.实验原理
酵母菌的纯培养
探究 实践
将单个微生物分散在固体培养基上的方法
稀释涂布平板法、平板划线法。
大小、形状、隆起程度、颜色等。
鉴定菌种的重要依据
微生物群
分散或稀释
单个细胞
繁殖
单菌落
酵母菌培养液、马铃薯、葡萄糖(或蔗糖)、琼脂、蒸馏水、天平、小刀、纱布、烧杯、锥形瓶、棉塞、牛皮纸(或报纸)、皮筋、培养皿、接种环、酒精灯、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、干热灭菌箱和恒温培养箱等。
2.目的要求
3.材料用具
(1)学会配制培养酵母菌的培养基并倒平板。
(2)学会进行无菌操作。
(3)尝试通过平板划线操作来获得纯化的酵母菌菌落。
4.方法步骤
配制
培养基
称取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000ml，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g葡萄糖(也可用蔗糖代替)、15～20g琼脂，用蒸馏水定容至1000ml。
灭菌
将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为100kPa、温度为121℃的条件下，灭菌15~30min。将5～8套培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在160～170℃灭菌2h。
倒平板
待培养基冷却到50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。
(1)制备培养基
培养酵母菌
制备培养基
接种和分离
倒平板注意事项：
①温度：50℃左右；
②操作：在酒精灯火焰附近；
③冷凝后平板倒置。
倒平板具体操作步骤：
平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以防止培养基表面的水分过快挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
避免杂菌污染。
琼脂在90℃以上熔化，在40℃左右凝固，倒平板时高于50℃则会烫手，低于50℃时，若不能及时操作，琼脂会凝固。
2.为什么倒平板时，将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不能完全打开？
防止杂菌污染培养基
1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？
可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉温度下降到刚刚不烫手即可。
3.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
最好不要用这个平板培养微生物。
防止空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
思考讨论
4.在接种前随机取若干个灭菌后的未接种的平板，先行培养了一段时间，这样做的目的是？
检测培养基平板灭菌是否合格。
(2)接种和分离酵母菌
平板划线法
通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。经过数次划线后培养可以分离得到单菌落。
分区划线法
原理：
单个细胞
微生物群
单个菌落
连续划线
分散或稀释
生长繁殖
①灼烧接种环，直至接种环金属丝烧红
②在火焰旁冷却接种环，拔出酵母菌培养液试管的棉塞
④在火焰附近用接种环蘸取一环菌液
⑥将皿盖打开一条缝隙，将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划3-5条平行线，盖上皿盖。
⑤试管口通过火焰，并塞上棉塞
③试管口通过火焰
⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。
平板划线的具体操作步骤
第1区划线
接种环灭菌
第2区划线
接种环灭菌
第3区划线
接种环灭菌
接种环灭菌
分区划线法
1
2
3
4
5
注意事项:
①接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次②划线首尾不能相接(最后一区不要与第一区相连)
③每次划线前接种环进行灭菌(在5个区域划线，接种环灼烧灭菌共6次)
④划线后,培养皿倒置培养
1.在灼烧接种环之后，要等其冷却再进行划线，目的是什么？
避免接种环温度过高，杀死菌种。
划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
①一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；
②存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落
3.为什么划线时要注意不能划破培养基？
2.除第一次划线外，每次划线都从上一次划线的末端开始，目的是什么？
思考:
4.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时,仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
灼烧时期 目的
取菌种前
每次划线前
接种结束后
杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞
杀死接种环上原有微生物，避免污染培养物。
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入 28℃ 左右(培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异)的恒温培养箱中培养 24~48h。
警示：在实验室中，切不可吃东西、喝水，离开实验室时一定要洗手，以防止被微生物感染。使用后的培养基在丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境。
(3)培养酵母菌
划3个平板(重复实验)和1个不划线(空白对照)
(1)在未接种的培养基表面是否有菌落生长 如果有,说明了什么
5.实验结果分析与评价
在未接种的培养基表面应该没有菌落生长，如果有，说明培养基被杂菌污染或灭菌不彻底。
可以在培养12h和24h后，观察菌落的大小、形状、颜色。培养24h后，菌落的大小、形状是否发生变化，菌落颜色是否加深，光泽度是否增加。
在接种酵母菌的培养基上可观察到单菌落。如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合酵母菌菌落的特点，则说明纯化酵母菌的操作成功；如果观察到了不同形态的菌落，可能是接种的菌种不纯或者无菌操作不规范等原因引起的。
(2)在接种酵母菌的培养基上,你是否观察到了单菌落 这些菌落的颜色、形状和大小是否一致 如果你观察到了不同形态的菌落,你能分析出可能是由哪些原因引起的吗
(3)你是如何记录实验结果的 请与其他同学交流、互评。
1.配制培养基的注意事项
(1)如果需要调节培养基的pH，应该在定容完成之后，灭菌之前进行操作。
(2)培养基灭菌后要冷却到50 ℃左右时开始倒平板。其原因是琼脂是一种多糖，在98 ℃以上熔化，在44 ℃以下凝固，倒平板时温度高于50 ℃会烫手，低于50 ℃时，若不及时操作，琼脂会凝固。
(3)倒平板时，要使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰。通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
(4)平板冷却凝固后，要将平板倒置。
(5)在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，那么这个平板不能用来培养微生物，因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
核心归纳
2.平板划线法接种菌种时，可防止杂菌污染的操作
(1)接种前将接种环放在酒精灯火焰上灼烧。
(2)划线操作在酒精灯火焰旁进行。
(3)接种环蘸取菌液前后，要将试管口通过火焰。
(4)划线时将培养皿的皿盖打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划线，划线后及时盖上皿盖。
核心归纳
思维训练
评估论点的可信程度
评估“水果酵素”的功效是否真实？
所谓“酵素”，就是“酶”的另一种说法。“酵素”制作就是利用微生物进行无氧呼吸的原理，进行像制作泡菜一样的发酵。 这样制作的“酵素”中可能有糖类(包括-些简单的糖和膳食纤维等)、蛋白质(包括多种酶)、有机酸等成分，不存在它独有的、特殊的营养物质，其中甚至可能含有微生物发酵产生的有毒物质，食用后可能会危害人体健康。因此，“吃水果酵素可以美容、减肥、促进消化和提高免疫力”的论点值得怀疑。
练习与应用
1.微生物的纯培养既需要适宜的培养基，又要防止杂菌污染。判断下列相关表述是否正确。
(1)培养基中的营养物质浓度越高，对微生物的生长越有利。( )
(2)消毒和灭菌的杀菌程度存在差异。( )
(3)微生物的纯培养物就是不含有代谢废物的微生物培养物。( )
一、概念检测
×
√
×
2.日常生活中保存食品的方法有哪些？这些方法是如何阻止或抑制微生物生长的？
日常生活中保存食品的方法有干制、腌制、低温储存等。干制可以降低食品的含水量；腌制可以通过食盐、糖等制造高渗环境，从而抑制微生物的生长和繁殖；低温储存通过降低微生物的代谢速率来抑制微生物的生长和繁殖。
1.某同学将5个手指尖在贴有“洗手前”标签的培养基上轻轻按一下。然后用肥皂将该手洗干净，再将5个指尖在贴有“洗手后”标签的同种培养基上轻轻按一下。将这两个培养皿放入37℃恒温培养箱中培养24h后，发现贴有“洗手后”标签的培养皿中菌落较少。请分析回答下列问题。
(1)这个实验中需要进行灭菌处理的材料用具有 。
(2)“将指尖在培养基上轻轻按一下”相当于微生物培养中的哪一步操作？
(3)从实验结果来看，洗手后我们就能进行无菌操作了吗？操作时，我们可以采用什么方法来避免手上微生物的污染？
二、拓展应用
通过实验结果可以看到，洗手后手上还有一些微生物，不能直接进行无菌操作。
可以通过用酒精棉球擦拭双手，或戴消过毒的手套等方法来避免手上微生物的污染。
培养皿和培养基
接种
练习与应用
(1)摇床转速不同，意味着培养条件有什么不同？
(2)从图中数据你可以得出什么结论 其原因是什么
(3)为什么培养8h后，其中2个锥形瓶中酵母菌的种群密度基本达到稳定？
2.某生物兴趣小组将从葡萄皮上成功分离来的野生酵母菌分别接种于3个盛有等量同种液体培养基的锥形瓶中，并放置在摇床上培养，摇床转速分别为210r/min、230r/min和250r/min。培养时间与酵母菌种群密度的关系如下图所示。请分析回答下列问题。
这时候已经达到了环境容纳量。
意味着培养液中O2含量不同。
培养液中02含量越高，酵母菌种群密度越大。
练习与应用
微生物的基本培养技术及应用
第2节
第一章 发酵工程
第2课时
微生物的选择培养和计数
SW-PWF
一、选择培养基
PCR是一种在体外DNA复制的技术，此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。
1973年，科学家在美国黄石国家公园的热泉中筛选出耐热的水生栖热菌，并从这种菌种提取出耐高温的DNA聚合酶。
1. 科学实例：
水生栖热菌能在70-80℃高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
耐高温的酶
耐高温生物体
耐高温环境（热泉、火山口）
寻找
寻找
寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
(1)筛选原因：
(2)启示：
一、选择培养基
耐寒微生物
耐热微生物
石油分解菌
2.实验室中微生物的筛选原理：
人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。
温泉
冰川
油田
一、选择培养基
3.选择培养基：
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
分离酵母菌、霉菌等真菌(青霉素能杀死细菌、放线菌)
分离固氮微生物
分离自养型微生物
④加高浓度食盐
金黄色葡萄球菌
⑤石油是唯一碳源
能消除石油污染的微生物
③不加含碳有机物
②不加氮源
①加入青霉素
选择培养基的作用：
分离并计数某种微生物的数量（例如，能分解尿素的细菌）
思考 讨论
选择培养基配方的设计
尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素被土壤中某些细菌分解成NH3,再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。这些细菌之所以能分解尿素，是因为能合成脲酶，来催化尿素分解。
讨论1： 如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？
设计一种选择培养基,用尿素作为唯一氮源,可以将分解尿素的细菌分离出来。
讨论2： 该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
该培养基与普通培养基相比较，共同点是都以有机碳作为碳源，都有水和无机盐；不同点是该培养基以尿素作为唯一氮源，使只有能以尿素作为氮源的微生物生长。
牛肉膏 5.0g
蛋白胨 10.0g
NaCl 5.0g
琼脂 20.0g
蒸馏水 定容到1000ml
KH2PO4 1.4g
NaH2PO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素CO(NH2)2 1.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 定容到1000ml
培养基一
培养基二
培养基一的碳源为_______，氮源为_______；培养基二的碳源为_______，氮源为______
牛肉膏
蛋白胨
葡萄糖
尿素
固体培养基
选择培养基
异养微生物
思考 讨论
选择培养基配方的设计
通常1g土壤中有几亿到几百亿个土壤微生物，其中，细菌的数量最多，能分解尿素的细菌是其中的一部分。
由于土壤细菌的数量庞大，要想得到特定微生物的纯培养物，仅有选择培养基是不够的，还需要对土壤进行充分稀释，然后再将菌液涂布到制备好的选择培养基上。
稀释涂布平板法
二、微生物的选择培养
①原理：通过对土样进行充分稀释，再将菌液涂布到制备好的培养基上，即可得到能分解尿素的细菌的纯培养物。
②两个基本操作：梯度稀释和涂布平板
二、微生物的选择培养
1、方法：稀释涂布平板法
(1)铲取土壤，将样品装入纸袋中。
(2)将10g土壤加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。
取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的是试管中，依次等比稀释。
二、微生物的选择培养
（1）土壤取样
（2）梯度稀释
（3）涂布平板
（4）恒温培养
1×10
1 mL
1 mL
1×107
1×106
1×105
1×104
1×103
1×102
9 mL 无菌水
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
90mL无菌水
(3)取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。
(4)将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
(5)将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，培养
(6)用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
3.培养：
二、微生物的选择培养
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30-37℃的温度下培养1-2d。在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落。
培养时要将一个未接种的培养基和一个已接种的培养基放在一起培养，为什么？未接种的培养基表面是否有菌落生长很关键，如果无菌落生长，说明了什么？
培养未接种的培养基的作用是对照。未接种的培养基在恒温箱中保温一段时间后，如果无菌落生长，说明培养基制备成功、合格，未受到污染。
用平板划线法接种培养结果的图片如下。请结合图片分析，平板划线法能否达到对细菌进行计数的目的？为什么？
不能。平板划线法最开始的划线很可能菌类会长成一片，导致无法计数，此外灼烧接种环的时候也会杀死一部分菌类。
与平板划线法相比，为什么稀释涂布平板法可以用于细菌的计数？
稀释涂布平板法会进行等比稀释，在合适的稀释倍数下，均匀涂布得到的菌落互不接触，可以确定菌类的密度，再通过计算可以得知原液的菌落数。
比较 平板划线法 稀释涂布平板法
主要步骤
工具
能否用于计数
菌体获取
结果
共同点
平板划线法和稀释涂布平板法的比较
涂布器
接种环
都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可以于观察菌落特征
不能计数
可以计数，但操作复杂，需涂布多个平板
接种环在固体平板培养基表面连续划线
①一系列的梯度稀释；
②涂布平板法操作
在具有显著的菌落特征的区域菌落中挑取菌体
从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体
阅读教材P18，思考问题：
1、微生物的数量测定方法有哪些？
2、与平板划线法相比，为什么稀释涂布平法发可以用于细菌的计数？如何计数？
3、稀释涂布平板法统计的细菌的个数与它的实际个数相同吗？
4、用显微镜进行直接计数的方法统计的细菌的个数与它的实际个数相同吗？
1.稀释涂布平板法
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
三、微生物的数量测定
除可以用于分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目
(1)原理
(2)操作过程
一般选择菌落数为30～300的平板进行计数。样品的稀释度将直接影响平板上的菌落数目，通常选用一定稀释范围的样品进行培养，在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。
数量测定方法：
稀释涂布平板法——间接计数法
显微镜直接计数法——直接计数法
(3)注意事项：
统计的菌落数往往比活菌的实际数目 ，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是 菌落。因此，统计结果一般用 而不是用活菌数来表示。
少
一个
菌落数
下图为“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验中样品稀释示意图。据图分析，每克土壤中的菌株数约为多少？
约为1.7×109个。
（4）计算
C代表某一稀释度下平板上生长菌落数的平均值；
V代表涂布平板时吸取的稀释液体积数值(mL)；
M代表稀释倍数；
则每g样品中的菌数=__________
（C÷V）×M
例.某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL) （ ）
A.2.34×108 B.2.34×109 C.234 D.23.4
B
=
同一稀释度下菌落数的平均值
吸取的稀释液体积
×稀释倍数
统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和。
三、微生物的数量测定
2.显微镜直接计数法：
①是一种常用的、快速直观的测定微生物数量的方法。该方法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定容积里样品中微生物的数量。
② *血细胞计数板常用对相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等；
细菌计数板可对细菌等较小的细胞进行观察和计数；
③优点：________
④缺点
（1）统计结果一般是_____________________ ，不能区分死菌与活菌,因此计数的结果比实际值大。
（2）个体小的细菌在显微镜下难以观察。
快速直观
活菌数和死菌数的总和
平板划线法能否达到对细菌进行计数的目的？为什么？
提示　不能，平板划线法最开始的划线很可能菌类会长成一片，导致无法计数，此外灼烧接种环的时候也会杀死一部分菌类。
3、微生物的计数方法比较
内容 显微镜直接计数法 稀释涂布平板法
主要用具 显微镜、细菌计数板或血细胞计数板 涂布器
计数依据 细菌个数 培养基上菌落数
优点 计数方便、操作简单 计数的是活菌
缺点 不能区分死菌与活菌 操作较复杂且有一定误差
计算公式 每毫升原液含菌株数＝400×1 000×每小格平均菌株数×稀释倍数 每毫升原液含菌株数＝
平均菌落数/所用涂布液体积×稀释倍数
探究·实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
1.实验目的
（1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌
（2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌
2.实验原理
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成__ ___的微生物才能分解尿素，利用____ ____________的_____ 培养基，可以从土壤中分离出___ ____的细菌
脲酶
以尿素作为唯一氮源
选择
分解尿素
常见的分解尿素的微生物：芽孢杆菌、小球菌、棒状杆菌等细菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。
3、制备培养基
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
琼脂 15.0g
蒸馏水 1000ml
制备选择培养基（尿素为唯一氮源）
制备牛肉膏蛋白胨培养基
用牛肉膏蛋白胨培养基作为对照组，
用以尿素为唯一氮源的培养基做实验组，
用来判断选择培养基是否具有选择作用。
①提供无机盐；
②调节pH。
探究·实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
（1）土壤取样
4、实验设计
细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大多数分布在距地表3～8cm 的土壤层。因此，取样时一般要铲去表层土。
取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。
操作完成后，一定要洗手。
测细菌数：一般用104、105、106稀释液
测放线菌：一般用103、104、105稀释液
测真菌数：一般用102、103、104稀释液
（2）样品的稀释
选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数
在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？
思考
测定土壤中细菌的数量，一般选用 倍稀释的稀释液进行平板培养，当第一次做这个实验时可以将稀释的范围放 一点。
1×104、1×105和1×106
宽
选择培养基
牛肉膏蛋白胨培养基
图中的1、2、3平板是选择培养基，4平板为牛肉膏蛋白胨培养基，以判断选择培养基是否具有筛选作用；另外，还要有两个对照，即不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基，以验证培养基中是否含有杂菌
①实验组：
1、2、3组接种的选择培养基 用以分离并计数能分解尿素的细菌
第4组接种的牛肉膏蛋白胨培养基 用以判断选择培养基是否具有
选择作用
②对照组：
第5组不涂布稀释液的选择培养基 用以验证培养基中是否含有杂菌
第6组牛肉膏蛋白胨培养基 用以验证培养基中是否含有杂菌
实验结果：前3组实验组分离得到单菌落；
第4组得到多种菌落；
第5,6组正常情况下无菌落。
①培养：根据不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d。
③一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。
②观察方法：每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
（3）微生物的培养与观察
(1)无菌操作:
(2)做好标记:
(3)规划时间:
本实验耗时较长，需要事先规划时间，以便提高实验效率，在操作时有条不紊。
①取土样的用具在使用前都需要 。
②实验操作均应在 进行。
5.操作提示
灭菌
酒精灯火焰旁
本实验使用的平板和试管较多，为避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的 等。
稀释度
如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。
6.结果分析与评价
如果没有接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。如果接种后的完全培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基筛选出了一些尿素分解菌。
1. 结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。
如果得到了两个或多个菌落数为30-300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。
2. 你是否获得了某一稀释度下菌落数 为30～300的平板？在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近？
3. 你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数是多少？与其他同学统计的结果接近吗？如果差异很大，可能是什么原因引起的？
甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。
1.甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。该同学的统计结果 (填“可靠”或“不可靠”)。若不可靠，应如何改进？
2.乙同学在该浓度下涂布了3个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学将21舍去，然后取平均值。该同学对实验结果的处理
(填“合理”或“不合理”)。微生物计数时，如果实验中出现重复实验的结果差别很大的情况，应 ，找出差异的原因，而不能简单地将结果舍弃后进行计数。
为增加实验的说服力与准确性，应设置重复实验，在同一稀释度下至少涂布3个平板，统计结果后计算平均值。
不可靠
不合理
分析实验过程中可能的影响因素
3.某同学在三种稀释度下取0.1 mL的菌液涂布平板，统计菌落数，得到了以下的数据，试计算1 g样品的活菌数。
平板 稀释度　　　 平板1 平板2 平板3
104 320 360 356
105 212 234 287
106 21 23 18
105的稀释度下取0.1 mL菌液涂布的三个平板上的菌落数在30～300范围内，计算其平均值为(212＋234＋287)/3≈244。进一步可以换算出1 g样品中活菌数为(244÷0.1)×105＝2.44×108(个)。
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。
CO（NH2）2+H2O CO2+2NH3
脲酶
原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→ 酚红变红→脲酶阳性
7.进一步探究
本活动只是初步筛选了能分解尿素的细菌，对分离的菌种进行鉴定还需要借助生物化学的方法。你可以查阅相关资料，进一步设计实验来鉴定自己分离的菌种。
①液体培养基可以直接看液体的变色情况；
②固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。
脲酶阴性
脲酶阳性
是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到伊红—美蓝培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记算得出水样中大肠杆菌的数量。
到生活中去
测定饮水中大肠杆菌数量的方法
选择培养基与鉴别培养基的比较
项目 选择培养基 鉴别培养基
原理
用途
举例
图示
加入不影响甚至促进目标微生物生长，而抑制或阻止其他种类微生物生长的化学物质
加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应
培养、分离出目标微生物
鉴别目标微生物
培养酵母菌和霉菌时，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌的生长；利用以尿素为唯一氮源的培养基来培养可分解尿素的细菌
可用伊红美蓝培养基鉴定饮用水或乳制品中是否含有大肠杆菌(若有，则菌落呈黑色)
练习与应用
1.研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌。判断下列相关表述是否正确。
（1）这种培养基是一种选择培养基。( )
（2）利用这种石油降解菌可以降解石油，修复土壤。( )
（3）相对于未被污染的土壤，从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌。( )
2.用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数，原因是( )
A.菌落中的细菌数目是固定的
B.平板上的一个菌落就是一个细菌
C.通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同
D.平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌
一、概念检测
√
√
√
D
二、拓展应用
1.反刍动物，如牛和羊，具有特殊的器官——瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设计一个实验，从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。
反刍动物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此从中分离能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基，还应该参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。
练习与应用
2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中40% ~ 60%能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用精杆等生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维素被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈(如下图所示)。请回答下列问题。
（1）现在要从土壤中分离纤维素分解菌，请你给出详细的实验方案。
可以参考本节“探究·实践”中的设计思路进行设计。
（2）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？
纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中，采集土样时，可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。
练习与应用
2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中40% ~ 60%能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用精杆等生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维素被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈(如下图所示)。请回答下列问题。
（3）有同学说可以把滤纸埋在土壤中，经过一段时间后，再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。
人工设置适合纤维素分解菌生存的环境，腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。
练习与应用
课堂小结
微生物的数量测定
选择培养基的作用
微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法
微
生
物
的
选
择
培
养
和
计
数
选择培养基
微生物的选择培养
科学实例
筛选原则
选择培养基的概念及举例
稀释涂布平板法的操作过程
间接计数法 — 稀释涂布平板法
直接计数 —计数板计数法
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
培养基的制备
（1）土壤取样
（2）样品的稀释
（3）稀释涂布平板法接种
（4）微生物的培养与观察
实验设计

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