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微生物的实验室培养
第一章 发酵工程
新冠病毒
禽流感病毒
微生物
将下列生物按照结构组成进行分类
大肠杆菌
酵母菌
草履虫
青霉
将下列生物按照结构组成进行分类
有细胞结构
原核生物：
真菌：酵母菌、霉菌(红曲霉、青霉)
细菌、蓝藻
病毒
结构简单的动植物：小球藻、草履虫
无细胞结构
真核生物：
微生物
微生物是难以用肉眼观察的微小生物的统称。包括细菌、真菌、病毒及一些原生生物等。本章主要指用于发酵的细菌和真菌。
饮用水的卫生标准：
1ml水样中细菌总数不得超过100个，1L水样大肠杆菌总数不得超过3个。
怎样判断一杯水中大肠杆菌数量是否符合标准？
问题探讨
不借助显微镜能看到微生物吗？
菌落：微生物在固体培养基表面或内部可以形成一个肉眼可见的、具有一定形态结构的子细胞群体。
思考：如何获得纯净的微生物培养物？
1.提供适合该微生物生长繁殖所需的营养物质和环境条件
2.确保其他微生物无法混入，并将需要的微生物分离出来
培养基的配制
无菌操作
分离纯化
培养基的配制
什么是培养基？
液体培养基
植物
组织
培养
培养基
固体培养基
？
琼脂
培养基：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
酵母菌
培养液
回忆酵母菌培养液和植物组织培养的培养基成分，我们应该如何培养大肠杆菌？向培养基中加入哪些成分？为什么要加入这些物质？
葡萄糖
氨基酸
无机盐
水
CHO
CNHONS
碳源
氮源
除了以上营养物质，还需要考虑哪些环境条件？
培养基的配制
无机盐
水
1.基本成分：水、碳源、氮源、无机盐
2.培养基内所需的其他条件
(1)pH
(4)特殊营养物质
(2)温度
(3)氧气的含量
霉菌-酸性，细菌-中性或弱碱性
如生长因子(细菌生长必需，而自身不能合成或合成不够的化合物)
例如乳酸杆菌-添加维生素
需氧/厌氧
培养基的配制
培养大肠杆菌时，常用牛肉膏蛋白胨培养基和LB培养基，
分析培养基的营养组成：
不同微生物利用的碳源相同吗？培养蓝藻所用的碳源？
培养基的配制
碳源、氮源、维生素
无机盐
碳源、氮源、维生素
水
碳源
无机碳源：
有机碳源：
CO2、CO32-、HCO3-
牛肉膏、蛋白胨、淀粉
氮源
无机氮源：
有机氮源：
NH4+、NO3-
牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等
自养微生物
异养微生物
1.基本成分：水、碳源、氮源、无机盐
培养基的配制
2.培养基内所需的其他条件
思考：
1.为何培养基中含有水、碳源、氮源、无机盐这四类基本成分？
2.病毒能用培养基直接培养么？
不能，病毒无法独立生存，必须寄生在细胞内。
这些物质含有微生物生长发育所需要的基本元素：C、H、O、N，
是合成生物大分子蛋白质、核酸等的必需元素。
培养基的配制
碳源
无机碳源：
有机碳源：
CO2、CO32-、HCO3-
牛肉膏、蛋白胨、淀粉
氮源
无机氮源：
有机氮源：
NH4+、NO3-
牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等
自养微生物
异养微生物
1.基本成分：
培养基的配制
培养基内所需的其他条件：
水、碳源、氮源、无机盐
2.培养大肠杆菌和硝化细菌时分别提供什么碳源和氮源？为什么？
pH、温度、氧气含量、特殊营养物质
3.分离某种微生物用哪一类培养基？
培养基的类型
根据物理状态分类
类型 配制特点 用途
液体培养基
半固体培养基
固体培养基
用于工业生产、连续培养
用于观察微生物的运动
用于微生物的分离、计数、鉴定、保藏菌种
不加凝固剂
加入凝固剂
加入少量凝固剂
培养基的类型
根据化学成分分类
合成培养基
天然培养基
培养基的类型
根据化学成分分类
培养基的类型
根据用途分类
选择培养基
概念：一种能将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基。
依据：微生物的特殊营养需求和生理功能特性
方法：在基础培养基中添加或去除某种物质，以达到允许特定种类的微生物生长,同时抑制或阻止其他种类微生物生长的目的。
例如：以纤维素为唯一碳源的培养基；添加了青霉素的培养基。
如何筛选出自养微生物？
培养基的类型
根据用途分类
鉴别培养基
概念：用于快速分类鉴定不同类型微生物，或分离和筛选产生某种代谢产物的微生物菌种的培养基
方法：在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成，该指示剂会与特定微生物的代谢产物发生颜色反应，借此区分该微生物与其他微生物。
例如：伊红美蓝培养基
培养基的类型
根据用途分类
煮沸消毒
（100℃，5～6min）常用
巴氏消毒
不破坏营养成分
化学药物消毒
可擦拭的表面、液体
紫外线消毒
空间消毒
获得纯净微生物的关键是防止杂菌污染
无菌技术
无菌技术
消毒
灭菌
使用较为温和的物理、化学和生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物
获得纯净微生物的关键是防止杂菌污染
无菌技术
无菌技术
消毒
灭菌
使用较为温和的物理、化学和生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物
使用强烈的理化方法杀死物体内外所有微生物，包括
芽孢(细菌休眠体-能经受高温、紫外线等)和孢子(繁殖体)
培养基
接种环
涂布器
培养皿
湿热灭菌
常用高压蒸汽灭菌
水蒸汽为介质，
100kPa ，121℃ ，15~30min
干热灭菌
耐高温，需要保持干燥
热空气为介质，
160~170℃ ， 2~3h
灼烧灭菌
接种用具如涂布器、接种环、接种针或其它金属用具
利用充分燃烧层灼烧
无菌技术
灭菌
使用强烈的理化方法杀死物体内外所有微生物，包括
芽孢(细菌休眠体-能经受高温、紫外线等)和孢子(繁殖体)
1.制备培养基 - 配制100mL培养基
①配制培养基：配制马铃薯-蔗糖-琼脂培养基
该培养基属于哪一类培养基？
微生物的纯培养
酵母菌的纯培养
②灭菌
1.计算
2.称量
3.溶化并定容
4.调pH
5.分装
1.制备培养基 - 配制100mL培养基
①配制培养基：配制马铃薯-蔗糖-琼脂培养基
微生物的纯培养
酵母菌的纯培养
分装试管：
培养基高度 1/5
不要污染试管口
棉塞塞紧
1.制备培养基 - 配制100mL培养基
①配制培养基：配制马铃薯-蔗糖-琼脂培养基
微生物的纯培养
酵母菌的纯培养
②灭菌：培养基装入锥形瓶中，加塞子，包牛皮纸；培养皿5~8套用牛皮纸包起来
对培养基和培养皿是消毒还是灭菌？用什么方法？
1.制备培养基 - 配制100mL培养基
①配制培养基：配制马铃薯-蔗糖-琼脂培养基
微生物的纯培养
酵母菌的纯培养
1.计算
2.称量
3.溶化并定容
4.调pH
5.分装
琼脂在98℃以上熔化，在44℃以下凝固，倒平板时高于50℃则会烫手，低于50℃时，若不能及时操作，琼脂会凝固。
③倒平板：待培养基冷却至50℃，在酒精灯火焰附近倒平板
②灭菌
1.制备培养基 - 配制100mL培养基
①配制培养基：配制马铃薯-蔗糖-琼脂培养基
微生物的纯培养
酵母菌的纯培养
③倒平板：待培养基冷却至50℃，在酒精灯火焰附近倒平板
4.等待培养基冷却凝固后，将培养皿倒过来放置。
1.拔出锥形瓶的棉塞。
2.将瓶口迅速通过火焰。
3.用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养皿（ 10 ～ 20mL）倒入培养皿，立即盖上盖子。
思考：
1.为什么要对瓶口进行灼烧？
2.为什么要在酒精灯火焰附近进行操作？
3.培养皿倒置的原因是什么？
微生物的纯培养
酵母菌的纯培养
避免微生物污染
防止冷凝后形成的水珠滴落在培养皿上，
污染或破坏菌落
1.消毒和灭菌的区别？
无菌技术
2.以下对象采用哪种无菌技术？
操作者
培养基
接种工具
玻璃器皿
空间
化学药物消毒
湿热灭菌
灼烧灭菌
干热灭菌
紫外线消毒
水蒸汽为介质，
100kPa ，121℃ ，15~30min
热空气为介质，
160~170℃ ， 2~3h
无菌技术
高压蒸汽灭菌锅
安全阀
压力表
排气阀
无菌技术
高压蒸汽灭菌锅
加水
装锅
加热
排出冷空气
水量达到水位标记线
将待灭菌物品放入灭菌锅中，不要装得过满，至少留1/3的空间
(随着锅内压力不断升高) ，打开排气阀，排出锅内冷空气
保温
保压
锅内压力升至100kPa，温度达到121℃时，控制热源、保持压力，维持15-30min，关闭电源
出锅
待压力表指针降至“0”点，待温度下降后，打开排气阀，旋开固定螺栓，开盖，取出灭菌物品
打开排气阀
无菌技术
高压蒸汽灭菌锅的使用及注意事项 - 核心归纳
1.取出灭菌桶，向外层锅内加入适量的水，水量达到水位标记线
2.装锅时不要装得太满
3.密封时，对称拧紧固定螺栓
4.加热时打开排气阀，排出冷空气，之后关上排气阀
5.压力自然下降至“0”点后，再打开排气阀。
如果突然打开排气阀，导致锅内压力突然下降，容器内的培养基由于内外压力不平衡会冲出容器口，造成培养基液体沾湿棉塞或溢出，易被杂菌污染。另外会对操作人员造成伤害，如被蒸汽烫伤或被高温液体溅伤。
无菌技术
高压蒸汽灭菌锅
1.(1)实验用的培养皿常用的两种灭菌方法是_ ____；为了减少灭菌后器皿被污染，灭菌前应该___ __。
(2)上图是灭菌锅及其局部剖面示意图，图中甲、乙、丙指示的依次是_____。（填序号）
①安全阀、放气阀、压力表
②放气阀、安全阀、压力表
③安全阀、放气阀、温度表
④放气阀、安全阀、温度表
干热灭菌和湿热灭菌
包扎
无菌技术
高压蒸汽灭菌锅
2.(多选)实验室常用高压蒸汽灭菌锅进行灭菌，下列相关叙述正确的是（　）
A．放入待灭菌物品后，关闭排气阀，即可打开电源加热
B．一般在压力为100kPa、温度121℃的条件下灭菌15～30min
C．高压蒸汽灭菌法可以杀灭物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子
D．若压力达到设定要求时，锅内没有达到相应温度，说明灭菌锅的温度计测量有误
BC
1.空间、操作者的衣着、手需要 和 。
无菌技术
2.培养皿、接种工具、培养基需要 。
清洁
消毒
灭菌
3.为避免微生物污染，应在 附近进行实验操作。
酒精灯火焰
4.实验操作时，应避免经灭菌处理的材料用具与周围物品接触。
无菌操作除了防止实验室的培养物被其他微生物污染之外还有什么作用？
避免操作者自身被微生物感染
微生物的纯培养
酵母菌的纯培养
1.培养物：接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类的微生物
2.纯培养物：培养基上由单一个体繁殖所获得的微生物群体
3.纯培养：获得纯培养物的过程
平板划线法
微生物的纯培养
酵母菌的纯培养
2.接种和分离酵母菌
原理：通过接种环在固体培养基表面 连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经数次划线后，可以分离得到单菌落。
平板划线法
微生物的纯培养
酵母菌的纯培养
A
B
C
D
E
F
4.在火焰附近用接种环蘸取一环菌液。
1.将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环的金属丝烧红。
2.在火焰旁冷却接种环。同时，拔出装出酵母菌培养液的棉塞。
3.将试管口通过火焰。
7.灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。注意不要将最后一次的划线与第一次的划线相连。
5.将试管口通过火焰，并塞上棉塞。
6.在火焰旁打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划 3 ～ 5 条平行线，盖上盖子。
平板划线法
微生物的纯培养
酵母菌的纯培养
1.将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环的金属丝烧红。
1.第一次划线前，灼烧接种环的目的是什么？
平板划线法
微生物的纯培养
酵母菌的纯培养
杀死接种环上的微生物，避免污染培养物
2.在火焰旁冷却接种环。同时，拔出装出酵母菌培养液的棉塞。
2.取菌液划线前，冷却的目的是什么？
避免温度过高杀死菌种
1.第一次划线前，灼烧接种环的目的是什么？
平板划线法
微生物的纯培养
酵母菌的纯培养
杀死接种环上的微生物，避免污染培养物
2.取菌液划线前，冷却的目的是什么？
避免温度过高杀死菌种
7.灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。注意不要将最后一次的划线与第一次的划线相连。
3.该步骤中，需要灼烧接种环吗？
每次划线后，灼烧接种环的目的是什么？
该步骤中，灼烧接种环后需要再次蘸取菌液吗？
杀死残留菌种，保证每次划线的菌种来自上次划线的末端
杀死残留菌种，避免污染环境和操作者
最后一次划线后，灼烧接种环的目的是什么？
3.培养酵母菌
菌液被培养基吸收后，将接种后的平板和一个 未接种的平板 （对照） 倒置 ，放入28℃左右的恒温培养箱培养24～48h。
思考：
1.为什么要放置一个未接种的培养基作对照？
2.平板为什么倒置？
3.培养后培养基如何处置才能废弃？
微生物的纯培养
酵母菌的纯培养
1．下列关于微生物实验操作的叙述，错误的是（ ）
A．培养微生物的试剂和器具都要进行高压蒸汽灭菌
B．接种前后，接种环都要在酒精灯火焰上进行灼烧
C．接种后的培养皿要倒置，以防培养污染
D．菌种分离和菌落计数都可以使用固体培养基
2．做“微生物的分离与培养”实验时，下列叙述正确的是（ ）
A．高压灭菌加热结束时，打开放气阀使压力表指针回到零后，开启锅盖
B．用记号笔标记培养皿中菌落时，不能标记在皿盖上
C．倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上
D．为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落
A
B
平板划线法
微生物的纯培养
酵母菌的纯培养
1.取菌液划线前，冷却的目的是什么？
避免温度过高杀死菌种
3.得到图示培养物需要灼烧几次接种环？ 每次灼烧的目的是什么？
6次；杀死接种环上的微生物，避免污染培养物；
杀死残留菌种，保证每次划线的菌种来自上次划线的末端；
杀死残留菌种，避免污染环境和操作者
2.为什么从上一次划线末端开始？
通过连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。
4.为什么不能划破培养基？
划破培养基难获得单个菌落
5.接种后为什么要放置1个未接种的平板和3个相同接种条件的平板？
实验注意事项
对照-判断平板是否被杂菌污染
重复原则
平板划线法
微生物的纯培养
酵母菌的纯培养
1.未接种的培养基表面是否有杂菌？
3.若不能确定这个菌落是由单细胞繁殖而来，应该怎么办？
2.表示酵母菌已被纯化的结果应该是怎样的？
最后一次划线末端出现单菌落
4.若没有观察到菌落，最可能的原因是？
5.若观察到了不同形态的菌落，请分析可能的原因有哪些？
结果分析
取菌液划线前没有冷却
配制培养基或操作过程中被其他微生物污染
2.取样
将菌液加入一定体积的无菌水，记录稀释倍数。
3.梯度稀释
将菌液与无菌水充分混匀。
用移液管取 1mL 上清液加入盛有 9mL 无菌水的试管中，吹吸混匀。
重复步骤3依次等比稀释。
稀释涂布平板法
微生物的纯培养
梯度稀释→涂布平板
1.取多个试管编号，
加入 9mL 无菌水。
稀释倍数
注意：在酒精灯火焰附近进行操作，操作前需将试管和移液管进行灭菌。
菌液(初始浓度)
④用涂布器将菌液均匀地涂布在选择培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
①取 0.1mL 菌液，滴加到培养基表面。
②将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
③将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
4.涂布平板（接种）
稀释涂布平板法
微生物的纯培养
梯度稀释→涂布平板
稀释涂布平板法
微生物的纯培养
梯度稀释→涂布平板
5.培养
待涂布的菌液被选择培养基吸收后，将平板倒置，放入30-37℃ 培养1-2d 。
6.观察
在适宜稀释度的平板上可以分离得到单菌落。
稀释涂布平板法
微生物的纯培养
1.用于计数的原理：
分离、计数(间接计数)
一个菌落源于一个活菌
稀释涂布平板法
微生物的纯培养
1.用于计数的原理：
分离、计数(间接计数)
一个菌落源于一个活菌
2.选择怎样的平板计数？
菌落数30-300之间的平板计数
恰当的稀释倍数是关键
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，推测出样品中大约有多少活菌
3.统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，原因可能是？
两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
血细胞计数板(厚、深)
细菌计数板(薄、浅)
稀释涂布平板法
- 间接计数
显微计数法
- 直接计数
微生物计数的方法
借助血细胞计数板或细菌计数板
稀释涂布平板法
- 间接计数
显微计数法
- 直接计数
微生物计数的方法
稀释涂布平板法 显微计数法
计数依据
优点
缺 点
计算结果
当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
不能区分死菌和活菌，都计算在内
培养基上的菌落数
菌体本身
计数的是活菌
操作简单
比实际偏小
比实际偏大
背景资料：尿素[CO(NH2)2]含氮量高，化学性质相对稳定，是现代农业产生中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解为NH3，NH3再转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。
课题目的：1.从土壤中分离出分解尿素的细菌
2.土壤中究竟含有多少这样的细菌？
课题探究
CO(NH2)2 + H2O
CO2 + 2NH3
脲酶
某些细菌：
讨论：培养基的类型和配方？
以尿素为唯一氮源的选择培养基
如何设置实验组和对照组？
怎样的结果说明配制的培养基有分离该细菌的效果？如何计算细菌的数量(公式)？
课题目的：1.从土壤中分离出分解尿素的细菌
2.土壤中究竟含有多少这样的细菌？
课题探究
请从成分、物理性质方面判断该培养基类型
讨论：培养基的类型和配方？
以尿素为唯一氮源的选择培养基
课题目的：1.从土壤中分离出分解尿素的细菌
2.土壤中究竟含有多少这样的细菌？
课题探究
实验流程：
1 ．取样
铲取土样，将样品装入纸袋中。
取样工具、纸袋需灭菌。
2 ．梯度稀释
将 10g 土样加入盛有 90mL 无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，配制土壤悬液，记录初始浓度。
取 1mL 上清液加入盛有 9mL 无菌水的试管中，依次等比稀释。
细菌
放线菌
真菌
④用涂布器将菌液均匀地涂布在选择培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
①取 0.1mL 菌液，滴加到培养基表面。
②将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
③将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
3.涂布平板（接种）
课题探究
实验流程：
4.培养
待涂布的菌液被选择培养基吸收后，将平板倒置，放入30-37℃ 培养1-2d 。
5.观察
在适宜稀释度的平板上可以分离得到单菌落。
课题探究
实验流程：
每隔24h统计菌落数，取数量稳定的时期做记录。
课题目的：1.从土壤中分离出分解尿素的细菌
2.土壤中究竟含有多少这样的细菌？
课题探究
结果分析与评价：
现象
分析
未涂布的选择培养基无菌落
无杂菌污染，培养基灭菌合格
未涂布的选择培养基有菌落
培养基被杂菌污染
基础培养基上菌落数多于
选择培养基
选择培养基有选择作用
课题目的：1.从土壤中分离出分解尿素的细菌
2.土壤中究竟含有多少这样的细菌？
课题探究
菌落计数：
计数原则：
1.30-300个菌落
2.至少选取3个平板重复计数，取平均值
3.若不符合30-300舍弃或重新实验
课题目的：1.从土壤中分离出分解尿素的细菌
2.土壤中究竟含有多少这样的细菌？
课题探究
菌落计数：
1 mL土壤样液稀释100倍,然后取0.1 mL稀释液均匀涂布在培养基表面,重复3个平板,在适宜条件下培养一段时间后,3个平板上的菌落数分别为70、73和75。可得出土壤样液中活菌数大约为7.3×107个/L
2. 对10 mL土样稀释106倍后,取0.1 mL该溶液进行重复的涂布实验,测得的菌落数分别为234、255、276,则该10 mL土样中分解尿素的细菌数为2.55×108个。
判断对错
(C/V)×稀释倍数
3. 若取10g土样，用无菌水定容至100mL，再稀释 105 倍，分别取 0.1mL 涂布在三个平板上，培养后三个平板上的菌落数依次为 45、50、55。
求每克土样中有多少分解尿素的细菌。
课题目的：1.从土壤中分离出分解尿素的细菌
2.土壤中究竟含有多少这样的细菌？
课题探究
菌落计数：
5*108
课题目的：1.从土壤中分离出分解尿素的细菌
2.土壤中究竟含有多少这样的细菌？
课题探究
分离出的都是能分解尿素的细菌吗？怎样鉴别？
鉴别培养基
CO(NH2)2 + H2O
CO2 + 2NH3
脲酶
分解尿素的细菌：
pH升高，遇酚红指示剂变红
保藏菌种：
短期保藏：
斜面培养/穿刺培养 4℃
扩大培养：
培养基 (物理状态)
液体
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红
长期保藏：
甘油-无菌水 -20℃
摇床 振荡培养
搁置斜面
从土壤中分离出分解纤维素的细菌并进行鉴定
课题探究
背景资料：
纤维素 纤维二糖 葡萄糖
刚果红是一种染料，可以与纤维素形成红色复合物，但并不和纤维素的水解产物(纤维二糖和葡萄糖)发生反应
流程？
配制选择培养基(以纤维素为唯一碳源)
取样、接种(稀释涂布平板法)、适宜条件培养
鉴定：接种于鉴别培养基(刚果红染色法)
出现透明圈的是纤维素分解菌，
透明圈越大说明分解纤维素的能力越强。
C1酶 Cx酶
葡萄糖苷酶
结果预期？
透明圈
巩固练习
1.细菌培养基的配制步骤是(　　)
A．配制培养液、调节pH、分装、灭菌、搁置斜面
B．配制培养液、灭菌、调节pH、分装、搁置斜面
C．配制培养液、灭菌、分装、调节pH、搁置斜面
A
2.为调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流水样中的细菌含量，并进行了细菌分离等工作。回答下列问题：
(1)该小组采用稀释涂布平板法检测水样中的细菌含量。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是 ；
然后，将1 mL水样稀释100倍，在3个平板上用涂布法分别接入0.1 mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37。据此可得出每升水样中的活菌数为 。
(2)该小组采用平板划线法分离水样中的细菌，操作时，接种环通过________灭菌，在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线。这样做的目的是__________________________________________________。
检测培养基灭菌是否充分
3.8x107
灼烧
将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落
巩固练习
(3)示意图A和B中，________表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。
(4)该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。结果发现：振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是：振荡培养能提高培养液中 的含量，同时可使菌体与培养液充分接触，提高 的利用率。
B
溶解氧
营养物质
巩固练习
发酵工程
第一章 发酵工程
1.概念：采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，在严格控制的环境条件下，大规模产生发酵产品或直接把微生物应用于工业生产过程的一种新技术。
发酵工程
青霉素是第一个应用于临床的抗生素，早期科学家只能从青霉菌中提取少量青霉素，其价格昂贵；随着高产菌种的选育、发酵工程的发展，青霉素可产业化生产，如今1瓶规格160万单位的青霉素注射剂仅1元。
思考：青霉素是怎样进行工业生产的？
2.流程：
选育菌种
扩大培养
配制培养基
灭菌
接种
发酵罐内发酵
分离、
提纯产品
获得产品
发酵工程
选育菌种
扩大培养
配制培养基
灭菌
接种
发酵罐内发酵
分离、
提纯产品
获得产品
选育菌种
从自然界中筛选、通过诱变育种或基因工程育种获得；
扩大培养
由于工业发酵罐体积较大，因此发酵之前先扩大培养；
发酵罐内发酵
这是发酵工程的中心环节，发酵过程中要随时检查微生物数量、产物浓度等，以了解发酵进程；还要及时添加必须的营养成分，严格控制温度、pH和溶解氧等发酵条件。
大型发酵罐有计算机控制系统进行检测和控制。
分离、
提纯产品
微生物细胞 - 过滤、沉淀等方法分离
代谢物 – 根据产物性质选择提取、分离和纯化的方法。
3.应用 在食品工业、医药工业、农牧业、其他方面的应用
发酵工程
发酵产品 菌种
酱油
柠檬酸
谷氨酸
乙肝疫苗
井冈霉素 (防治水稻枯纹病)
单细胞蛋白
霉菌(黑曲霉)
黑曲霉
谷氨酸棒状杆菌
转入乙肝病毒抗原基因的酵母菌
放线菌
酵母菌、细菌等
产生蛋白酶将蛋白质水解为多肽和氨基酸
微生物农药-生物防治
不是纯蛋白质，是菌体本身，
无需提取、纯化蛋白质
3.应用 啤酒的工业化生产流程
发酵工程
原理：
淀粉
酒精+CO2
葡萄糖
A
B
糖化
发酵
发芽
研磨
焙烤
糖化
发酵
蒸煮
终止
消毒
淀粉酶将淀粉水解成糖浆(麦芽糖、葡萄糖)
酵母菌
参与
杀死大多数微生物，延长保存期
终止酶的作用
灭菌糖浆
(终止麦芽生长)
降低水分,加热杀死种子胚
温度不使淀粉酶失活
产生淀粉酶
赤霉素
促进种子萌发
增大微生物与粮食的接触面，有透气性，便于发酵
判断正误
A.用赤霉素处理大麦,可使大麦种子无须发芽就能产生α-淀粉酶
B.焙烤是为了利用高温杀死大麦种子胚并进行灭菌
C.糖浆经蒸煮、冷却后需接种酵母菌进行发酵
3.应用 啤酒的工业化生产流程
发酵工程
发酵食品 腐乳 泡菜 酸奶 果酒 果醋
主要发酵菌种 (易污染菌种)
菌种来源
菌种代谢类型
发酵温度
发酵原理
传统发酵技术
毛霉
空气中的孢子
异养需氧型
15-18°C
毛霉分泌的胞外酶将豆腐中的脂肪和蛋白质分解为小分子物质。
乳酸菌
(白膜-酵母菌)
蔬菜表面
异养厌氧型
乳酸菌无氧条件下，
糖类→乳酸。
乳酸菌
酵母菌
(菌膜-醋酸菌)
水果表面
异养兼性厌氧型
18-30°C
酵母菌有氧条件下，
大量繁殖；
酵母菌无氧条件下，
糖类→酒精+CO2
有氧条件下，将糖分解为乙酸+CO2；直接将乙醇——乙醛——乙酸。
30-35°C
异养需氧型
空气中
醋酸菌
发生的场所
细胞质基质
细胞质基质
细胞质基质
微生物的实验室培养
培养基的配制
无菌技术
微生物的纯培养
培养基的
基本成分&条件
培养基的类型-用途
配制步骤
计算、称量、溶化、
定容、调pH、分装、
灭菌、倒平板/搁置斜面
消毒
煮沸消毒
巴氏消毒
化学药物消毒
紫外消毒
灭菌
湿热灭菌(高压蒸汽灭菌)
干热灭菌
灼烧灭菌
接种方法：
平板划线法
稀释涂布平板法
(计数)
扩大培养、菌种保藏
碳源
无机碳源：
有机碳源：
CO2、CO32-、HCO3-
牛肉膏、蛋白胨、淀粉
氮源
无机氮源：
有机氮源：
NH4+、NO3-
牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等
自养微生物
异养微生物
1.基本成分：水、碳源、氮源、无机盐
2.培养基内所需的其他条件
微生物的实验室培养
pH、温度、氧气含量、特殊营养物质
微生物的实验室培养
培养基的配制
无菌技术
微生物的纯培养
培养基的
基本成分&条件
培养基的类型-用途
配制步骤
计算、称量、溶化、
定容、调pH、分装、
灭菌、倒平板/搁置斜面
消毒
煮沸消毒
巴氏消毒
化学药物消毒
紫外消毒
灭菌
湿热灭菌(高压蒸汽灭菌)
干热灭菌
灼烧灭菌
接种方法：
平板划线法
稀释涂布平板法
(计数)
扩大培养、菌种保藏
微生物的实验室培养
微生物的实验室培养
培养基的配制
无菌技术
微生物的纯培养
培养基的
基本成分&条件
培养基的类型-用途
配制步骤
计算、称量、溶化、
定容、调pH、分装、
灭菌、倒平板/搁置斜面
消毒
煮沸消毒
巴氏消毒
化学药物消毒
紫外消毒
灭菌
湿热灭菌(高压蒸汽灭菌)
干热灭菌
灼烧灭菌
接种方法：
平板划线法
稀释涂布平板法
(计数)
扩大培养、菌种保藏
微生物的实验室培养
1.培养基是依据人们的需求配制出的供微生物生长繁殖的营养基质
2.为纯化某菌种,某小组在鉴别培养基上划线接种了该种细菌
B.图中的菌落均由同种微生物形成
C.从3区挑取单菌落后进行培养可获得纯培养物
D.该培养基使用完之后,无须再进行灭菌处理
判断正误
3.
B.倒平板后培养基需要进行灭菌处理
C.图示结果表明该菌需要生长因子乙或丙
微生物的实验室培养
P12 T6.以下是实验人员利用影印法初检氨基酸营养缺陷型菌株的过程:
(1)过程①的接种方法为　　　　　　　。与基本培养基相比,完全培养基中特有的成分是　　　　　　。
基础培养基：仅能满足微生物野生型菌株生长
完全培养基：能满足营养缺陷型菌株生长(依据不同的实验目的富含氨基酸、维生素、生长因子等)
微生物的实验室培养
P12 T5.研究人员按照如图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解S的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基,甲的组分为无机盐、水和S,乙的组分为无机盐、水、S和Y。
B.稀释涂布平板操作中,要将接种环在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧灭菌
C.④过程中各培养瓶中的S溶液要有一定的浓度梯度
D.若培养基中的S浓度过高,菌株对S的降解能力可能会下降
判断正误
P7 T2
①培养基、锥形瓶都要进行干热灭菌
②家庭制作葡萄酒时要将容器和葡萄进行灭菌处理
③干热灭菌可以杀死微生物的营养细胞和部分芽孢
④涂布平板时所用的涂布器需酒精浸泡后灼烧灭菌
⑤家庭制作泡菜并无刻意的灭菌环节,发酵中期乳酸菌产生的乳酸可以抑制其他微生物生长
微生物的实验室培养
判断正误
3.4周末卷答案 – 传统发酵技术
3.4周末卷答案 – 微生物的培养基
3.4周末卷答案 – 无菌操作和接种技术

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