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第2节 微生物的培养技术及应用
二 微生物的选择培养和计数
高压蒸汽灭菌
液体培养基
课题背景
自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，更难实现。
稀释涂布平板法呈现的杂菌群
那么我们又如何达成这一目标呢？
科学家们应用选择性培养基解决了这一难题。
一、选择培养基
美国黄石国家公园的一个热泉
1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌，进而提取出耐高温的DNA聚合酶。
为什么水生栖热菌能从热泉中筛选出来呢？
实验室微生物的筛选时，可人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。
因为水生栖热菌能在70-80℃的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
一、选择培养基
1.概念：
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基
2.原理：
人为提供_________________的条件（包括_____、_____和_____等），同时___________________________。
有利于目的菌生长
抑制或阻止其他微生物的生长
营养
温度
pH
3.举例：
（1）利用改变培养条件进行选择培养。
70～80℃的高温
分离耐高温的水生栖热菌
使用将pH调至酸性的培养基
分离耐酸菌
（2）利用营养条件进行选择培养
不加碳源（含碳有机物）的培养基
分离出自养型微生物
不加氮源的培养基
分离出固氮菌
（3）利用添加某种化学物质进行选择培养
加入青霉素
分离酵母菌、霉菌等真菌
那么如果让你分离土壤中分解尿素的细菌，你应该怎么设计呢？
选择培养基配方的设计
尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可以作为细菌生长的氮源。
讨论：1.如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？
在选择培养基中，以尿素作为唯一氮源，只有能合成脲酶的细菌才能生长发育繁殖
2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
除以尿素作为唯一氮源外，该培养基的其他营养成分与普通培养基基本相同
如果想知道1g土壤中有多少能分解尿素的细菌，还需对土壤菌液进行稀释及科学的微生物数量测定方法---稀释涂布平板法。
二、微生物的选择培养
1.方法：
稀释涂布平板法
2.操作流程
①铲取土样，将样品装入纸袋中
②将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
1ⅹ107
1ⅹ105
1ⅹ106
1ⅹ103
1ⅹ102
1ⅹ104
9mL无菌水
1ⅹ10
90mL无菌水
1mL
1mL
1mL
1mL
1mL
1mL
③取0.1mL菌液，滴加到（选择）培养基表面。
④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布
⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
注意事项：
①10g土样加入盛有90mL无菌水中后，已稀释10倍，在计算时，不要忽略；
②由于使用的是选择培养基，所以一般情况下，获得的单菌落即目的菌，但因为有些微生物可以利用目的菌的代谢产物来生长繁殖，所以还需要进一步验证；
③过程中所有操作都应在酒精灯火焰旁进行；
④将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧；不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。
待涂布的菌液被__________后，将平板_____，放入___________中培养____d，在涂布有________菌液的平板上就可以观察到分离的_______；
培养基吸收
倒置
恒温培养箱
1-2
合适浓度
单菌落
稀释涂布平板法除可以分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目；
稀释103倍
稀释104倍
稀释105倍
空白对照
恒温培养箱
放入37℃恒温箱中培养1～2d
三、微生物的数量测定
——间接计数法
1.稀释涂布平板法
（1）原理：
当样品的稀释度足够___时，培养基表面生长的一个____，来源于__________中的一个____；通过计数平板上的____数，就能推测出样品中大约含有多少_____；
高
菌落
样品稀释液
活菌
菌落
活菌
（2）计数原则
①选择菌落数为_______的平板计数
30-300
②同一稀释度下，应至少对___个平板进行重复计数，然后求出______；
3
平均值
样品的______将直接影响平板上的菌落数目；
稀释度
（3）结果分析：
①统计的菌落数往往比活菌的实际数目____；
原因：__________________________________________
______________
②统计结果一般用_______而不是用活菌数来表示；
少
当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
菌落数
（4）计算公式：
每g样品中的菌落数＝(C÷V)×M
C 代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数
V 代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)
M 代表稀释倍数
实例分析1：
甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？
（80+90+100）/3
0.1
× 105 =9 ×107个
两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释
倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。
1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。
2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、
212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。
你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？
甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）
乙：其中一个平板计数结果与其他两个相差太大，操作过程可能出现了错误。
实例分析2：
2.显微镜直接计数
——直接计数法
（1）方法：
利用特定的___________或_____________在______下观察、计数，然后再计算_________的样品中微生物的数量；
细菌计数板
血细胞计数板
显微镜
一定体积
血细胞计数板常用于_______________________________等的计数
相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子
细菌计数板可对_________________进行观察和计数；
细菌等较小的细胞
（2）优点：
快速直观
（3）缺点：
①统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和，不能区分死菌与活菌。
②个体小的细菌在显微镜下难以观察。
每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数
四、探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1.提出问题（实验目的）
（1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌。
（2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。
2.实验原理
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成_____的微生物才能分解尿素，利用___________________的_____培养基，可以从土壤中分离出_________的细菌。
组分 含量
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
琼脂 15.0g
H2O 定容至1000mL
脲酶
以尿素作为唯一氮源
选择
分解尿素
CO(NH2)2+H2O
脲酶
2NH3+CO2
3.实验步骤
（1）土壤取样
①取样地点要求：
酸碱度接近中性的潮湿土壤。细菌适宜在该环境中生长。
②取样过程：
铲去表层土（一般3cm左右）。细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。
③注意事项：
取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。
（2）制备培养基
①选择培养基：
以尿素为唯一氮源
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
琼脂 15.0g
蒸馏水 1000ml
②牛肉膏蛋白胨培养基：
作为对照组，来判断选择培养基是否具有选择作用
（3）样品的稀释与涂布平板
（稀释涂布平板法）
测细菌时，一般选用104、105、106倍稀释的稀释液进行平板培养
在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，应选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数。
①每个浓度至少设置4个平板，1、2、3平板是选择培养基（实验组，三个重复），4为牛肉膏蛋白胨培养基
（用以判断选择培养基是否具有选择作用）
②如何验证培养基中是否含有杂菌？
设置2个平板作为对照：
不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基
注意事项：
本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。
（4）微生物的培养与观察
①培养条件：
不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。
（细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d）
②观察：
每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。（一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等）
（5）结果分析
现象
分析
未涂布培养基上无菌落生长
未涂布培养基上有菌落生长
牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目明显多于选择培养基上的菌落数目
培养基未被杂菌污染
培养基被杂菌污染
选择培养基具有选择作用
①结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。②你是否获得了某一稀释度下菌落数为30～300的平板 在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近 ③你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数是多少 与其他同学统计的结果接近吗 如果差异很大，可能是什么原因引起的 如果没有接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。如果接种后的完全培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基筛选出了一些尿素分解菌。如果得到了两个或多个菌落数为30～300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。
可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。
（5）进一步探究——分解尿素细菌的进一步鉴定
①原理：
细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发生了该化学反应，进而判断该菌是否为尿素分解细菌。
②方法：
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红：
液体培养基：
可以直接看液体的变色情况；
固体培养基：
平板划线法稀释涂布平板法纯化原理接种工具单菌落的获得用途接种效果图相同点通过连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释程度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养，以得到单菌落接种环涂布器从最后划线的区域挑取稀释度合适，整个平板上都可找到单菌落分离纯化菌种，获得单菌落①分离纯化菌种，获得单菌落②用于计数①都能分离纯化菌种；②都是在固体培养基上进行的两种纯培养方法的比较
微生物的培养
基础知识
实验操作
结果分析与评价
培养基
定义：
分类：
无菌技术
定义：
消毒与灭菌
常用灭菌方法
制备选择培养基
纯化酵母菌
小结
课堂检测

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