资源简介

(共35张PPT)
5.表达载体上有哪些元件/部件？
6.对目的基因和载体使用双酶切是为了：
2.原核生物与真核生物基因的区别：
4.与基因组文库相比，cDNA文库中的基因序列缺少：
8.复制原点、启动子、起始密码子分别起始哪些过程？化学本质分别是？
7.通常用同种酶切割目的基因和载体是为了：
复制原点、启动子、目的基因、终止子、标记基因
防止目的基因和质粒自身环化，
防止目的基因反向连接
产生相同的末端
有无内含子/编码区是否连续
非编码区和内含子
复制、转录、翻译；DNA、DNA、RNA
1.基因工程的操作步骤包括哪几步？核心步骤是？
3.获取目的基因的方法？
基因组文库、cDNA文库、化学合成法、PCR
9.选择限制酶的注意事项：
1 2 3 4
6
5
4
5
1 2
3 4 1
2
1.选择产生不同末端的酶
2.酶切位点在启动子下游和终止子上游；不能切割载体的启动子、终止子、复制原点、标记基因
3.不能切割目的基因内部
选酶1和酶3
将目的基因导入受体细胞
将目的基因导入
微生物细胞
将目的基因导入
动物细胞
将目的基因导入
植物细胞
转化的概念:目的基因进入受体细胞，并且在受体细胞内维持稳定并表达的过程，称为转化。
Ca2+处理
-感受态
显微注射法
花粉管通道法、农杆菌转化法、基因枪法
将目的基因导入受体细胞
植物细胞
（2）农杆菌转化法
大型环状DNA
（可转移的DNA）
农杆菌生活在土壤中的微生物，自然条件下可侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
转移到被侵染的细胞，
并且将其整合到该细胞的染色体DNA上
目的基因
Ti质粒
表
达
载
体
农杆菌
植物细胞
植物细胞
染色体DNA
新性状植株
构建
转入
导入
插入
表达
将目的基因导入受体细胞
植物细胞
（2）农杆菌转化法
将目的基因导入受体细胞
植物细胞
（2）农杆菌转化法
1.构建重组Ti质粒需要的工具酶？
2.为什么一定要插入T-DNA上？
3.将基因表达载体导入农杆菌时应怎样处理农杆菌？
4.受体细胞是普通的体细胞能否得到转基因植株？
5.说明两次拼接和两次导入的对象和过程
①转基因植物用 ；
②转基因动物用 (一般不能用体细胞)；
原因是： 。
③微生物作为受体细胞的优点是 。
④要合成糖蛋白、有生物活性的分泌蛋白等则受体细胞为 ，
原因是 ；
⑤一定不能用哺乳动物成熟的红细胞，
原因是 。
真核细胞
分泌蛋白等需内质网、高尔基体等的加工
受精卵有发育的全能性
无核，无器，不能合成蛋白质
体细胞或受精卵
受精卵
单细胞，繁殖快；遗传物质相对较少，易于培养操作
将目的基因导入受体细胞
总结-受体细胞的选择
目的基因的检测与鉴定
将表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？
即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？
首先：
其次：
接着：
最后：
还要：
标记基因
检测目的基因是否导入受体细胞
检测转基因生物的DNA是否插入目的基因
目的基因的检测与鉴定
检测转基因生物的DNA是否插入目的基因
变性
基因探针：
放射性同位素或荧光标记的单链DNA分子
待测DNA
杂交DNA分子
互补的核苷酸序列通过碱基配对形成稳定的杂合双链DNA分子的过程称为杂交。
方法：DNA分子杂交技术
目的基因的检测与鉴定
检测转基因生物的DNA是否插入目的基因
方法：DNA分子杂交技术
醋酸纤维素膜
目的基因的检测与鉴定
将表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？
即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？
首先：
其次：
接着：
最后：
还要：
标记基因
DNA分子杂交技术
检测目的基因是否导入受体细胞
检测转基因生物的DNA是否插入目的基因
检测目的基因是否转录出mRNA
目的基因的检测与鉴定
检测目的基因是否转录出mRNA
探针
转基因生物
的mRNA
杂交分子
（可检测）
方法：分子杂交技术
目的基因的检测与鉴定
将表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？
即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？
首先：
其次：
接着：
最后：
还要：
标记基因
DNA分子杂交技术
分子杂交技术
抗原-抗体杂交技术
检测目的基因是否导入受体细胞
检测转基因生物的DNA是否插入目的基因
检测目的基因是否转录出mRNA
检测是否翻译出蛋白质
目的基因的检测与鉴定
检测是否翻译出蛋白质
方法：抗原-抗体杂交技术
原理：抗原抗体的特异性结合
苏云金杆菌
提取
Bt抗虫蛋白
标记抗体
提取蛋白
电泳分离
抗原
抗体
杂交
抗原
转基因生物
目的基因的检测与鉴定
将表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？
即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？
首先：
其次：
接着：
最后：
还要：
标记基因
DNA分子杂交技术
分子杂交技术
抗原-抗体杂交技术
功能活性鉴定
检测目的基因是否导入受体细胞
检测转基因生物的DNA是否插入目的基因
检测目的基因是否转录出mRNA
检测是否翻译出蛋白质
个体生物水平鉴定
目的基因的检测与鉴定
个体生物水平鉴定
方法：功能活性鉴定
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒（菌）植物
抗盐植物
抗除草剂植物
获取目的基因产物的转基因生物
饲喂害虫（抗虫接种实验）
害虫死亡
病毒（菌）接种实验
未染病
盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
功能、活性正常
目的基因的检测与鉴定
Bt基因
mRNA
Bt抗虫蛋白
抗虫棉
DNA分子杂交技术
抗原-抗体杂交技术
分子
水平
抗虫鉴定
个体水平
分子杂交技术
利用PCR获取和扩增目的基因
第三章 基因工程
全称
聚合酶链式反应
DNA半保留复制
体外（PCR扩增仪/PCR仪）
可以在短时间内大量扩增目的基因
原理
操作环境
优点
PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）的缩写。
即在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，
对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
PCR的概念和原理
DNA的基本单位？共有几种？每一分子基本单位由哪些部分构成？
回顾DNA复制
体内DNA复制的特点？
半保留复制、边解旋边复制、半不连续复制
子链延伸的方向？
5’→3’
回顾DNA复制
体内DNA复制参与的组分 在DNA复制中的作用
打开DNA双链
提供DNA复制的模板
合成子链的原料
催化合成DNA子链
DNA聚合酶只有延伸DNA链的能力，没有起始合成DNA链的能力，怎么办？
解旋酶
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物
体内DNA复制的条件
使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
引物：是一小段与DNA母链的一小段碱基序列互补配对的短单链核酸（20-30个核苷酸）。
PCR原理
PCR中参与的组分 在DNA复制中的作用
打开DNA双链
提供DNA复制的模板
合成子链的原料
催化合成DNA子链
解旋酶
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物
PCR条件
使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
资料：DNA在80-100℃时，双螺旋结构变性解旋，双链分开，这个过程称为变性；当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。
高温
DNA热变性原理：
PCR和DNA的体内复制过程是否完全相同？
不完全相同；PCR是双链全部解开后再延伸子链
DNA双链
单链
变性（加热94℃ ）
复性（冷却55℃ ）
加热会影响DNA聚合酶的活性，如何解决？
PCR中参与的组分 在DNA复制中的作用
打开DNA双链
PCR条件
高温
先解旋后复制
PCR原理
PCR中参与的组分 在DNA复制中的作用
打开DNA双链
提供DNA复制的模板
合成子链的原料
催化合成DNA子链
解旋酶
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物
PCR条件
使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
高温
DNA（目的基因）模板
dNTP
Taq酶
耐高温的DNA聚合酶
PCR原理
dATP
腺嘌呤脱氧核苷酸
dADP
腺苷（A)
腺嘌呤
脱氧
核糖
P
P
P
~
~
OH
H
在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP）
既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。
PCR条件
PCR原理
PCR中参与的组分 在DNA复制中的作用
打开DNA双链
提供DNA复制的模板
合成子链的原料
催化合成DNA子链
解旋酶
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物
PCR条件
使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
高温
DNA（目的基因）模板
dNTP
耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）
引物对
（通常为小的单链DNA）
PCR原理
引物：是一小段与DNA母链的一小段碱基序列互补配对的短单链核酸（20-30个核苷酸）。
3’
5’
DNA母链
3’
5’
DNA母链
3’
5’
引物
3’
5’
引物
PCR原理
使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。
第1组： ；
第2组： 。
引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效
引物Ⅰ′自身内部部分碱基发生互补配对而失效
PCR原理
PCR条件-设计引物的原则
PCR原理
PCR条件-设计引物的原则
1.长度适宜
2.CG含量适宜
3.引物自身及引物之间不应存在互补序列
4.引物5’端可以修饰(无需碱基互补配对)，3’端不可修饰
5.确保引物序列只在扩增的基因中出现，与其他基因不具有互补性
否则自身形成发夹结构或二聚体，影响引物与模板复性结合。
若要通过PCR获取目的基因，如何选择引物？
PCR原理
PCR条件-设计引物的原则
目的基因
引物A
引物B
引物C
引物D
1.是否需要已知目的基因的全部序列？
不需要全部序列，但要已知目的基因两端的序列
2.要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？
引物E
在两种引物的5’端分别添加上限制酶的识别序列
PCR中参与的组分 在DNA复制中的作用
打开DNA双链
提供DNA复制的模板
合成子链的原料
催化合成DNA子链
解旋酶
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物
PCR条件
使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
高温
DNA（目的基因）模板
dNTP
耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）
引物对
（通常为小的单链DNA）
PCR原理
缓冲液
维持稳定的pH，
含有激活Taq酶的Mg2+
PCR循环
耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）
4种脱氧核苷酸（dNTP）
引物
待扩增的DNA片段（模板）
5’
5’
变性
退火(复性)
延伸
温度上升到94℃左右，双链DNA解旋为单链
当温度下降到55℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在Taq酶的作用下合成新的DNA链。
过程
PCR循环
1.1个循环包括哪些过程？
变性、退火、延伸
2.如何控制不同的过程？
控制温度
3.变性、退火、延伸的温度分别是多少？
94℃，55℃，72℃
4.变性温度一定是94℃吗？退火温度一定是55℃吗？与哪些因素相关？
不一定，模板DNA长度；引物GC含量越高、长度越长，退火温度越高。
5.经过n次循环后可得到多少DNA片段：
共需要消耗多少对引物：
2n
2n-1
PCR-练习
1.PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应（ ）
2.PCR过程中使用的DNA聚合酶的特点是耐高温（ ）
3.PCR技术中，DNA模板链上碱基CG比例越高，DNA变性的温度越高（ ）
4.下列有关体内DNA复制与PCR技术比较的叙述，错误的是（ ）
A.二者子链的延伸方向相同，均为5’端→3’端
B.二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋
C.体内DNA复制需要能量，PCR反应也需要能量
D.二者遵循的碱基互补配对原则相同
×
√
√
B

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