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第49讲 基因工程和蛋白质工程
1.概念:指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品
2.别名: 。
3.原理: 。
4.操作对象: 。
5.操作水平: 。
6.操作环境: 生物 （体内/体外）进行
7.结果： 。
8.优点： （1） 。
（2） 等。
基因重组
DNA分子水平
基因拼接技术或DNA重组技术
基因
体外
创造出符合人们需要的生物类型和生物产品
定向改造生物性状
克服远缘杂交不亲和的障碍
一.基因工程概述
1.人的胰岛素基因为什么能通过拼接并在受体细胞大肠杆菌中表达出相同蛋白质。
能表达的基础：
① 基因是控制生物性状和遗传的独立遗传单位
② 遗传信息的传递都遵循中心法则
③ 生物界共同一套遗传密码
理论基础：
能拼接的基础：
①DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。
②双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。
③都遵循碱基互补配对原则
“分子手术刀”
“分子缝合针”
“分子运输车”
二、基因工程的基本工具
1.分子手术刀”-限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)
原核生物
数千
特定核苷酸序列
磷酸二酯键
黏性末端
二.基因操作基本的工具
（1）该DNA片段上EcoRI的识别序列在哪儿？
（2）请用剪刀模拟EcoRI的识别序列和切割位点将目的基因“切割”下来。
探究 活动一、用剪刀模拟EcoRI剪切目的基因(Bt基因)操作
(3)要想获得某个特定性状的目的基因必须要用限制酶切几次？可产生几个黏性(平)末端？切割后的目的基因上有几个黏性（平）末端
要切2次，产生4个黏性(平)末端；目的基因上有2个
教材隐性知识：
(1)源于选择性必修3 P71“旁栏思考”：①原核生物中存在限制酶的意义是什么？
原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害。
②限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？
限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰（甲基化），使限制酶不能将其切开。
下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点．请回答下列问题：
(1)DNA序列经过上表中几种限制酶识别切割后，可以获得 种黏性末端的DNA片段。
三
(2)用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，可以同时使用 两种限制酶同时处理质粒、外源DNA，这样处理的优点 。
BamH I和Hind Ⅲ（或EcoR I、Hind Ⅲ或EcoR I、BamH I）
防止目的基因、质粒的自身环化以及目的基因反向连接在质粒
改编：(3)若启动子在质粒上方，目的基因上链为模板链右方为3端，则应选取 两种限制酶同时处理质粒、外源DNA
EcoR I、Hind Ⅲ
选择限制酶切割位点的基本原则：
A.确保质粒和目的基因产生相同的粘性末端
B . 不破坏目的基因和质粒上的标记基因、启动子、终止子、复制远点等原件（至少保留一个完整的标记基因，便于筛选 ）
C.最好采用双酶切法切割目的基因和质粒，防止目的基因、质粒的自身环化以及目的基因反向连接在质粒上
还需要考虑连接的方向
1.（2023·湖北·统考高考真题）用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（　　）
A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）
培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电
泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受
体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培
养基中能形成菌落
D
标记基因：筛选出含有目的基因的细胞（有的细胞只含有质粒不含有目的基因故还需要进行目的基因及表达产物检测。）
2.（2023·浙江·统考高考真题）紫外线引发的DNA损伤，可通过“核苷酸切除修复（NER）”方式修复，机制如图所示。着色性干皮症（XP）患者的NER酶系统存在缺陷，受阳光照射后，皮肤出现炎症等症状。患者幼年发病，20岁后开始发展成皮肤癌。下列叙述错误的是（　　）
A．修复过程需要限制酶和DNA聚合酶
B．填补缺口时，新链合成以5’到3’
的方向进行
C．DNA有害损伤发生后，在细胞增殖
后进行修复，对细胞最有利
D．随年龄增长，XP患者几乎都会发生
皮肤癌的原因，可用突变累积解释
C
（2021年湖北真题）
3．限制性内切酶EcoRI识别并切割
双链DNA，用EcoRI完全酶切果蝇基因组DNA，理论上得到DNA片段的平均长度（碱基对）约为（ ）A．6 B．250 C．4000 D．24000
C
例4.下列所示的黏性末端是由几种限制性核酸内切酶作用产生的（　　）
①
A.1种 B.2种 C.3种 D.4种
D
图中的黏性末端哪些能连接在一起？
、 。
①② ③④
② ③ ④
1.不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端
2.相同的黏性末端能够碱基互补配对，能被DNA连接酶缝合
二.基因操作基本的工具
2.DNA连接酶
磷酸二酯键
大肠杆菌
黏性末端
黏性末端
（从T4噬菌体入侵的细菌中提取）
教材隐性知识：DNA连接酶和DNA聚合酶
(2)源于选择性必修3 P72“旁栏思考”：DNA连接酶和DNA聚合酶
　　(填“是”或“不是”)一回事。原因是：①DNA连接酶连接的是　　　　　　，而DNA聚合酶是把单个的　　　　　连接到已有的DNA片段上。②　　　　　起作用时需要以一条DNA链为模板，而　　　　　不需要模板。
不是
两个DNA片段
脱氧核苷酸
DNA聚合酶
DNA连接酶
例6（2023年重庆真题）某小组通过PCR（假设引物长度为8个碱基短于实际长度）获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切（下图），再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是（ ）
A．其中一个引物序列为5＇TGCGCAGT-3＇B．步骤①所用的酶是SpeI和CfoIC．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2个片段D．酶切片段和载体连接时，可使用E．coli连接酶或T4连接酶
B
一般是经人工改造的
3.载体
二.基因操作基本的工具
噬菌体
受体DNA上
限制酶酶切位点
标记
且对受体细胞无害
总结：易错点拨
(1)质粒与拟核中的DNA有哪些相同点：（至少写出两点）
① 。
② 。
③ 。
(2)质粒 （是/不是）一种细胞器。
(3)细胞膜上的载体蛋白与基因工程中的载体的区别
①化学本质不同：细胞膜上的载体： 。基因工程中的载体可能是物质，如 ；也可是生物，如 ；
②功能不同：细胞膜上的载体功能是 ;基因工程中的载体是一种“分子运输车”,把 。
化学本质和结构相同
能够自我复制
具有遗传效应或都能够指导蛋白质的合成等
不是
蛋白质
质粒
动植物病毒噬菌体
协助细胞膜控制物质进出细胞
目的基因导入受体细胞
（2020，高三，衡水）目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒，pBR322质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如图一所示：
(1)构建人工质粒时要有抗性基因，以便于______________________________。观察上图，如果A为质粒，则C表示 。
便于重组DNA的筛选或（筛选出含有目的基因的细胞）
重组质粒
(2)pBR322分子中另有单个的BamHⅠ限制酶作用位点，现将经BamHⅠ处理后的质粒与用另一种限制酶BglⅡ处理得到的目的基因，通过____________作用连接，成功地获得了重组质粒。能形成重组质粒的原因是______________________________________________。
DNA连接酶
两种限制酶切割得到的黏性末端相同
(4) 作为受体大肠杆菌应不含________________，以方便筛选已导入重组质粒的受体大肠杆菌。将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落。再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果(空圈表示与图二对照无菌落的位置)。图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是______________。切割目的基因的限制酶应为_________。（EcoRI或BamHI）
ampR和tetR
pBR322 质粒
BamHI
(1)实验原理
4.DNA的粗提取与鉴定
二.基因操作基本的工具
0
DNA溶解度
NaCl浓度
0.14mol/L
2mol/L
(2)实验步骤
0
DNA溶解度
NaCl浓度
0.14mol/L
2mol/L
1.低温可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；
2.低温抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；
3.低温有利于增加DNA的柔韧性，减少断裂。
1.目的基因的获取
三.基因操作基本操作程序
2、从基因文库中直接获取
1、人工合成
3、利用PCR获取和扩增目的基因
在已知目的基因核苷酸序列且基因较小的情况下，利用DNA合成仪自动合成
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
基因组文库:
部分基因文库:
包含一种生物的全部基因
（cDNA文库）
基因文库类型：
包含一种生物的部分基因
【思考1】从基因组文库中获得的胰岛素基因，若以大肠杆菌作为受体细胞却未得到对应的胰岛素，其原因可能是？故将真核生物的基因导入原核生物，应该从什么文库中获取？
胰岛素基因含内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出胰岛素；cDNA文库
【思考2】
从部分文库中获得的胰岛素基因，若以大肠杆菌作为受体细胞却未得到对应的胰岛素，其原因可能是？该如何改进？
大肠杆菌无内质网、高尔基体等细胞器，对胰岛素原不具有加工、修饰、分泌功能；
需要在体外加工形成胰岛素或将目的基因导入酵母菌中获得产物。
关于抗虫棉Bt毒蛋白（教材隐性知识）：
源于选择性必修3 P77“相关信息”：Bt抗虫蛋白基因产生的Bt抗虫蛋白只在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈　　，肠道细胞也无特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生危害。
酸性
（2023山东真题）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有 （答出2个结构即可）。(2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物 。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的 （填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。
RNA聚合酶
限制酶切割位点、标记基因、复制原点等
F2和R1或F1与R2
（1）构建目的：
；
。
（2）构建过程：
2.基因表达载体的构建—基因工程的核心：
同种限制酶
若只考虑两两连接，质粒和目的基因至少可以连接 种；即 。
3
目的基因-目的基因、质粒-质粒、目的基因-质粒
①使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代。
②使目的基因能够表达和发挥作用
三.基因操作基本操作程序
思考：基因表达载体，只含有目的基因就可以了吗？
注意：1.生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；
2.为了增强目的基因的表达水平，有时还要增加一些其他调控元件，如增强子等；
2.基因表达载体的构建—基因工程的核心：
如：乳腺生物反应器是将药用蛋白基因与乳腺蛋白基因的启动子重组在一起
位于哪？作用？
1（2023·辽宁·统考高考真题）CD163蛋白是PRRSV病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起（如下图），使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去（ ）
A．CD163基因中编码起始密码子的序列
B．CD163基因中编码终止密码子的序列
C．RFP基因中编码起始密码子的序列
D．RFP基因中编码终止密码子的序列
B
3.转化的方法：
导入植物细胞
导入动物细胞
导入原核细胞
花粉管通道法、农杆菌转化法
显微注射法、病毒介导法
Ca2+处理法（感受态法）
三.基因操作基本操作程序
农杆菌转化法
①农杆菌特点：易感染 植物，对大多数 植物没有感染能力。
②原理：Ti质粒上的 可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。
双子叶植物和裸子
单子叶
T-DNA
感染植物细胞，把目的基因插入到植物细胞的染色体的DNA上
受伤的
叶片伤口处的细胞可释放大量的酚类物质，可吸引农杆菌，有利于目的基因成功转化
a.农杆菌的作用是 。
b.用农杆菌感染时，优先选择 （受伤的/完好的）叶片细胞与重组质粒的农杆菌培养，选用该叶片的理由是 。
c.农杆菌转化法有两次导入与拼接：
第一次是是将目的基因拼接到Ti质粒的T DNA上并导入农杆菌，第二次(非人工操作)是将含目的基因的T DNA导入植物细胞，并将含目的基因的T DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上
导入的目的基因，可能存在于细胞质中，也可能整合到染色体DNA上。染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入其他作物中，造成“基因污染”。　　　
花粉管通道法（我国独创）
在植物授粉后一定时间内，剪去
柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。
适用生物：开花植物
据图回答：（1）B基因在水稻卵细胞中不转录，推测其可能的原因是卵细胞中 。A．含B基因的染色体缺失 B．DNA聚合酶失活C．B基因发生基因突变 D．B基因的启动子无法启动转录
B基因存在于水稻基因组中，其仅在体细胞（2n）和精子中正常表达，但在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响，设计了如下实验。
D
B基因存在于水稻基因组中，其仅在体细胞（2n）和精子中正常表达，但在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响，设计了如下实验。
（2）从水稻体细胞或 中提取总RNA，构建 文库，进而获得B基因编码蛋白的序列。将该序列与Luc基因连接成融合基因，然后构建重组表达载体。
精子
cDNA
B基因存在于水稻基因组中，其仅在体细胞（2n）和精子中正常表达，但在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响，设计了如下实验。
（3）在过程①、②转化筛选时，过程 在培养基中应加入卡那霉素。
过程 中T-DNA整合到受体细胞染色体DNA上，
②
①
①常用法: .
②常用菌： 。
③过程：
Ca2+处理法(感受态细胞法)
大肠杆菌
单细胞、繁殖快、遗传物质相对少
④受体细胞用Ca2+处理的目的是
。
⑤用Ca2+处理受体细胞是通过改变 的通透性来完成
使其变为感受态细胞，容易吸收周围环境中的DNA分子
细胞壁
Ca2+处理细胞
感受态细胞
表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA
微生物作为受体细胞有哪些优点？
将目的基因导入微生物细胞
Bt基因
mRNA
Bt抗虫蛋白
抗虫棉
PCR与核酸分子杂交技术检测
抗原 — 抗体杂交技术
分子
水平
抗虫鉴定
（个体水平）
4.目的基因的检测与鉴定
三.基因操作基本操作程序
a.检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因可采用DNA分子杂交技术。
b.检测目的基因是否成功转录出mRNA可采用核酸分子杂交技术。
例6.(2021·山东，25)人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点，该位点结合BCL11A蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上
游不同长度的片段，将这些片段分别
插入表达载体中进行转化和荧光检测，
以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位
置。相关信息如图所示。
(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是______，在R末端添加的序列所对应的限制酶是________。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要____种酶。
SalⅠ
EcoRⅠ
6
(2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞，成功转化后，含F1～F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是___________________________________________________。
F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达
据此结果可推测， BCL11A蛋白结合位点位于___________________
___________________________，理由是_______________________
__________________________________________________________
列上所对应序列之间的区段上
引物F4与F5在调控序
根据有无荧光情况判断，
F1～ F4与R扩增产物上均有结合
位点，因此结合位点位于F4所对
应调控序列的下游(右侧)；F5～F6与R扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游(左侧)，所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上
三.基因工程的应用【考点讲解】
1.基因工程在农牧业方面的应用
抗虫功
能的基因
抗
病基因
降解或抵抗
蛋白质编
码基因
花青素代谢相关的基因
外源生长激素基因
乳糖酶基因
乳汁
基因改造
显
微注射
抗原决定基因
克隆
免疫排斥
2.基因工程在医药卫生领域的应用
基因改造
显
微注射
抗原决定基因
克隆
免疫排斥
三.基因操作基本操作程序【考点讲解】
2.基因工程在医药卫生领域的应用
（1）乳房（乳腺）生物反应器：
。
①具体做法：
将 基因与 等调控组件重组在一起，通过 方法，导入哺乳动物的 中，将其送入母体，使其发育成转基因动物
转基因动物进入泌乳期后，可以通过分泌的乳汁来生产所需药品
药用蛋白
乳腺蛋白基因的启动子
显微注射
受精卵
②目的基因可在乳腺细胞中表达，其他组织细胞中含有该目的基因吗？ 。理由是：
。
③若是膀胱生物反应器，为何更容易得到目的基因的产物的原是 。
含有
因为它们都是由同一个受精卵分裂、分化而来的
不受性别和发育时期的限制
4.（2023·湖南·统考高考真题）盐碱胁迫下植物应激反应产生的H2O2对细胞有毒害作用。禾本科农作物AT1蛋白通过调节细胞膜上PIP2s蛋白磷酸化水平，影响H2O2的跨膜转运，如图所示。下列叙述错误的是（ ）
A．细胞膜上PIP2s蛋白高磷酸化水平是其提高H2O2外排能力所必需的
B．PIP2s蛋白磷酸化被抑制，促进H2O2外排，从而减轻其对细胞的毒害
C．敲除AT1基因或降低其表达可提高禾本科农作物的耐盐碱能力
D．从特殊物种中发掘逆境胁迫相关基因是改良农作物抗逆性的有效途径
B

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