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(共23张PPT)
第一节　体液调节是通过化学信号实现的调节
第一节　体液调节是通过化学信号实现的调节
第三章 动物细胞工程
第二节　神经系统通过下丘脑控制内分泌系统
第二节　神经系统通过下丘脑控制内分泌系统
第三节 通过细胞融合可产生具有新特性的细胞
目 录
细胞融合技术
制备单克隆抗体
单克隆抗体技术的应用
与植物体细胞杂交技术中的原生质体融合类似，动物细胞工程中也包括细胞融合技术。
那么，两个动物细胞是如何融合成一个细胞？融合技术有什么应用？
1.概念：
2.范围：
在一些融合因子的作用下，将两个或多个细胞合并形成一个细胞的技术。
细胞融合技术
①基因型相同的细胞间
②基因型不同的同种生物细胞间
3.诱导方式？
③亲缘关系非常远的不同种生物细胞间
因为原生质体不会自动融合，想想植物细胞融合有哪些方法？
①物理法：电刺激、离心、振动
②化学法：聚乙二醇（PEG)
1875年，科学家们首次观察到了脊椎动物（蛙）血液细胞的融合现象。1958年，日本科学家岗田用灭活的仙台病毒诱导人的腹水癌细胞融合成功。
①物理法：电流刺激（电脉冲）、激光融合
②化学法：聚乙二醇（PEG)
③生物法：灭活的病毒
（动物细胞融合特有）
3.诱导方式
一、两个或多个动物细胞经诱导可融合形成一个细胞
灭活的病毒诱导机理
什么是灭活的病毒？
灭活是指用物理或化学手段使病毒失去感染能力，但是并不破坏病毒的抗原结构。
灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面
↓
细胞膜被病毒颗粒穿通
↓
细胞膜连接
↓
细胞核融合，形成杂交细胞
病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合
4.诱导机理/原理：细胞膜出现一定程度损伤，细胞相互粘连而融合。
细胞膜的流动性
5.结果：
形成的杂交细胞具有原来两个或多个细胞的遗传信息。
6.意义：
突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能，克服远缘杂交不亲和
7.应用：
（1）在染色体基因定位上的应用
（2）制备单克隆抗体
植物体细胞杂交 动物细胞融合
原理
细胞融合前的处理方法
诱导细胞融合的方法
细胞融合成功的标志
主要用途
意义
细胞膜具有一定的流动性、植物细胞的全能性
细胞膜具有一定的流动性
用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁
用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞
电融合法、离心法；聚乙二醇（PEG）融合法
PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法
再生出细胞壁
细胞核的融合
获得完整的杂种植株
主要用于制造单克隆抗体
打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种
突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能
2024/2/26
动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较
二、细胞融合技术是制备单克隆抗体的基础
1.早期获得抗体的方法
向动物体内反复注射某种抗原
从动物血清中分离所需抗体
产量低、纯度低、特异性差
（能识别多种抗原）
缺点：
多克隆抗体
思考：
1.抗体的本质是什么？如何产生的？
2.用传统的方法如何获取抗体？
3.此方法能否快速、大量获取我们想要的某种抗体？为什么？
二、细胞融合技术是制备单克隆抗体的基础
2.单克隆抗体
B淋巴细胞在体外培养条件下不能无限增殖
克隆单一的B淋巴细胞，得到的细胞群就能分泌出化学性质单一、特异性强的抗体
制备思路：
困难：
若要得到大量的单一抗体，我们该如何去做？
资料：
人们发现，在动物发生免疫反应的过程中，体内有上亿种B淋巴细胞可以产生多达百万种以上的特异性抗体，但是每一种B淋巴细胞只分泌一种化学性质单一、特异性强的抗体。要想获得大量的单一抗体，必须用克隆单个B淋巴细胞形成细胞群。
米尔斯坦
科勒
由于发明了单克隆抗体的制备技术，米尔斯坦和科勒于1984年获得了诺贝尔生理学或医学奖
大胆设想：
B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
（能产生抗体）
（能大量增殖）
融合细胞
（既能产生抗体，又能大量增殖）
他们利用仙台病毒使经羊红细胞免疫的、从小鼠脾脏分离的B 淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合。寿命有限的B淋巴细胞与具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合，经筛选后就可以获得既能产生特异性抗体，又能在正常培养条件下进行无限增殖的杂交瘤细胞。通过对杂交瘤细胞进行传代培养，就能长久地得到针对羊红细胞的单克隆抗体了。
（1）单克隆抗体制备的过程：
2024/2/26
注射特定的抗原
培养骨髓瘤细胞
从脾中提取
B淋巴细胞
多种
骨髓瘤细胞
诱导融合
将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合
能产生抗体，但不能大量增殖
不能产生抗体，但能大量增殖
PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法
目的是获得产生特定抗体的B淋巴细胞
多种杂交细胞：
未融合的细胞
B-骨、
骨-骨、
B-B、
第一次筛选：
用特定的HAT选择培养基
在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长
多种杂交瘤细胞：
（既能迅速大量增殖，又能产生抗体）
（能产生所需抗体的杂交瘤细胞）
此杂交瘤细胞包括能分泌所需抗体的细胞和产生其他抗体的细胞。如何筛选？
阅读教材P82-83课外读
多种杂交细胞：
未融合的细胞
B-骨、
骨-骨、
B-B、
第一次筛选：
用特定的HAT选择培养基
杂交瘤细胞：
（既能迅速大量增殖，又能产生抗体）
第二次筛选：
克隆化培养、抗体检测
（可进行多次）
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞
（分泌的抗体能与特定抗原结合）
每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞
克隆化培养
多孔细胞培养板
（能产生所需抗体的杂交瘤细胞）
在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长
抗体检测板
多孔细胞培养板
阳性孔
抗体检测的方法——抗原-抗体杂交法
将杂交瘤细胞群稀释（极限稀释），约每孔1个细胞进行培养
一段时间后，检测各孔上清液中细胞分泌的抗体
上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔
分泌抗体能跟特定抗原结合的细胞即为所需杂交瘤细胞
知识拓展：筛选获得能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
克隆培养
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞
（分泌的抗体能与特定抗原结合）
注射到小鼠腹腔内
体外培养
单克隆抗体
从细胞培养液中提取
从小鼠腹水中提取
（能产生所需抗体的杂交瘤细胞）
第一次筛选 第二次筛选
原因
方法
结果
诱导融合后得到的细胞中，除杂交瘤细胞之外，还有未融合的亲本细胞，也有融合的具有同种核的细胞
由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经第一次筛选之后获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞
用特定的HAT选择培养基进行筛选
多孔细胞培养板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下，进行克隆化培养和抗体检测（进行多次筛选）
筛选获得杂交瘤细胞
获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
两次筛选的比较
应用到的技术：
原理：
细胞膜具有一定的流动性、细胞增殖
多种杂交细胞及未融合的细胞
诱导 融合
小鼠骨髓瘤细胞
多种B淋巴细胞
给小鼠注射特定抗原
提取
杂交瘤细胞
第一次筛选
用特定的选择性培养基
第二次筛选
足够数量的能产生所需抗体的杂交瘤细胞
体外培养
注射到小鼠腹腔
大量单克隆抗体
克隆化培养、抗体检测
（既能迅速大量增殖，又能产生抗体）
（产生抗体）
（能无限增殖）
从腹腔液中提取
从培养液中提取
归纳：
（可进行多次）
动物细胞融合、
动物细胞培养
产生所需（特异性）抗体的杂交瘤细胞克隆培养的途径：体外和体内
将培养液离心获取抗体，并进一步分离、纯化、检测便可获得单克隆抗体可用于免疫标记测定，若用于日常诊断、或定性研究不需纯化。（液体里还有各种氨基酸、维生素、指示剂蛋白质、核酸、毒素和病毒）
纯度高，可大量制备，在应用时具备特异性强、灵敏度高。
如利用脊髓灰质炎病毒的单克隆抗体做诊断试剂
（2）单克隆抗体的优点：
(3)单克隆抗体的应用
①广泛用作诊断试剂
②直接用于治疗疾病。
实例：利妥昔单抗（美罗华）是一种针对CD20抗原的人鼠嵌合型单克隆抗体，是第一个被FDA批准用于临床治疗的单抗。进入人体后能通过介导抗体依赖的细胞毒性作用、补体依赖的细胞毒性作用和抗体与CD20分子结合引起的直接效应，抑制细胞生长，改变细胞周期以及凋亡等方式杀死淋巴瘤细胞。
使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用。抗体-药物偶联物（antibody-drugconjugates, ADC）通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由抗体、接头和药物(如细胞毒素)三部分组成，它的作用机制如下图所示。
抗体
药物
接头
ADC被细胞吞噬
释放药物
溶酶体裂解
细胞凋亡
单克隆抗体+药物 =“生物导弹”
(“生物导弹” —单抗导向，药物为弹头)
优点：位置准确、疗效高、副作用小
③运载药物：
如ADC。
思考：单克隆抗体的制备过程中的几个问题：
（2）两次筛选的目的相同吗？
（1）给小鼠注射抗原的目的是什么？
（3）三次培养的目的是什么？
（4）该过程运用了哪些技术？
动物细胞培养技术、动物细胞融合技术。
诱导小鼠体内发生特异性免疫应答，产生B淋巴细胞
第一次筛选：淘汰未融合或自融合的细胞，得到正确融合的杂交瘤细胞。
第二次筛选：淘汰不能产生所需抗体的细胞，最终获得能产生最佳特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞。
第一次是培养B淋巴细胞、骨髓瘤细胞，并使两种细胞融合；
第二次是培养杂交瘤细胞，筛选出能产生特异抗体的杂交瘤细胞。第三次是培养能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，便于提取大量的（单克隆）抗体。

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