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第2节 动物细胞工程
第1课时：动物细胞培养
第二章
【从社会中来】
在治疗大面积烧伤时，通常采用的方法是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植。但对这样的病人来说，自体健康皮肤非常有限，使用他人皮肤来源又不足，而且会产生免疫排斥反应。
讨论：异体移植面临的问题： 。
供体器官短缺、免疫排斥等
获得大量的自体健康皮肤的方法： 。
取少量正常、健康的皮肤在体外进行培养、扩增；
皮肤干细胞培养（研究中）
通过细胞培养构建的人造皮肤
通过细胞培养构建的人造皮肤
在治疗大面积烧伤时，通常采用的方法是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植。但对这样的病人来说，自体健康皮肤非常有限，使用他人皮肤来源又不足，而且会产生免疫排斥反应。那么，
怎样才能获得大量的自体健康皮肤？能不能用自体皮肤的单个细胞培养出可供移植的皮肤？
【提示】可以从病人身上取少量正常、健康的皮肤在体外进行培养、扩增。目前,科学家还在研究对皮肤干细胞进行培养,以获得适合临床上使用的人造皮肤。
新课引入
2.2动物细胞工程
动物细胞培养(基础）
动物细胞融合
动物细胞核移植
动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。
④. 培养对象：
胚胎或幼龄动物的细胞
幼龄个体的细胞分化程度低、分裂能力强，易培养。
1、动物细胞培养
①. 概念：
②. 原理：
③. 地位：
动物细胞工程的基础
从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，
然后在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。
细胞分裂（增殖）
【思考】：动物组织的选择： 幼龄动物 or 老龄动物
幼龄个体的细胞分化程度低、分裂能力强，易培养。
⑤. 目的：
获得细胞或者细胞产物
动物体
组织
单个细胞
细胞生长和增殖
取出
分散
适宜条件
一.动物细胞培养的条件及过程
我们知道，动物体内的细胞之所以能够维持正常的生命活动，有些细胞还能不断增殖，是因为机体给这些细胞提供了适宜的条件，包括充足的营 养、稳定的内环境等。在体外培养动物细胞，也需要满足类似的条件。一般来说，动物细胞培养需要满足以下条件
2.动物细胞培养的条件
动物细胞培养的
条件
营养物质
稳定的
内环境
<
<
糖类
氨基酸
无机盐
维生素
无菌、无毒的环境
适宜的温度、pH和渗透压
适宜的气体环境
一.动物细胞培养的条件及过程
2.动物细胞培养的条件
①营养
葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等
a.合成培养基：将细胞所需的营养物质按照种类和所需量严格配制而成的培养基。
b.天然成分：血清
人们对细胞所需的营养物质尚未全部研究清楚，在使用合成培养基时，通常需要加入血清等一些天然成分。
c.培养动物细胞一般使用液体培养基，也叫培养液
②.无菌、无毒的环境
无菌：
①对培养液和所有培养用具进行灭菌处理
②在无菌环境下进行操作
定期更换培养液，以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞
自身造成危害
无毒：
一.动物细胞培养的条件及过程
2.动物细胞培养的条件
③适宜的温度、pH和渗透压
哺乳动物多以（36.5±0.5）℃为宜。
温度：
pH：
多数细胞生存的适宜pH在7.2-7.4
渗透压：
动物细胞培养过程中需要考虑的一个重要环境参数，维持细胞正常的形态和功能。
O2:
细胞代谢所必需的
CO2：
主要作用是维持培养液的pH
微生物培养中的作用不同（为自养型微生物提供碳源）
④气体环境
在进行细胞培养时，通常采用培养皿或松盖培养瓶，并将它们置于含有95%空气和5% CO2的混合气体的CO2培养箱中进行培养。
一.动物细胞培养的条件及过程
2.动物细胞培养的条件
松盖培养瓶
培养皿
培养瓶
CO2培养箱
一.动物细胞培养的条件及过程
为什么对动物细胞进行培养时通常要添加血清？
1、血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等，
2、氨基酸有多种，是细胞合成蛋白质的基本成分，其中有些氨基酸动物细胞本身不能合成（称为必需氨基酸），必须由培养液提供。
3、血清激素有胰岛素、生长激素等及多种生长因子；血清还含有多种未知的促细胞生长因子、促贴附因子及其他活性物质，这是细胞生长和增殖所必需的，能促进细胞的生长、增殖和贴附。
4、因此，细胞培养时，要保证细胞能够顺利生长和增殖，一般需添加10%～20%的血清。
一.动物细胞培养的条件及过程
1.为何动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞呢？
可用什么方法？
2.体外培养动物细胞有哪些类型？
3.什么是细胞贴壁？什么是接触抑制？
4.什么是原代培养和传代培养？
5.为什么要进行分瓶培养？怎么处理？
6.动物细胞培养与植物组织培养有什么相同之处与不同之处？
阅读教材P44-45,思考并回答下列问题：
3. 动物细胞培养的过程
一.动物细胞培养的条件及过程
放入CO2培养箱中培养
取动物组织
传代培养
制备细胞悬液
原代培养
转入培养液中
放入CO2培养箱中培养
用机械的方法，或用胰蛋白酶，胶原蛋白酶等处理的方法，将组织分散成单个细胞
分瓶培养
离心、收集细胞
一.动物细胞培养的条件及过程
①选动物幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料的原因？
这些个体的细胞生命力旺盛，细胞分化程度低、分裂能力强，易培养。
②培养前为什么分散成单个细胞？
a.分散的细胞不会限制彼此的生长与增殖；
b.使细胞与培养液充分接触，一方面保证细胞所需氧气和营养的供应，
另一方面保证细胞内代谢产物的及时排出。
c.使得在细胞水平操作的其他得以实现。
3. 动物细胞培养的过程
动物组织
分散成单个细胞
机械法：胰蛋白酶
胶原蛋白酶处理
一.动物细胞培养的条件及过程
③常用胰蛋白酶分散细胞，这说明细胞间的物质主要是什么成分？用胃蛋白酶行吗？
说明细胞间的物质主要是蛋白质(胶原蛋白等)。
胃蛋白酶作用的适宜pH约为2，当pH大于6时，胃蛋白酶就失去活性，多数动物细胞培养的适宜pH为7.2~7.4，胃蛋白酶在此环境中没有活性，所以不能用胃蛋白酶。
④实验过程中，胰蛋白酶处理时间过长，会出现什么结果？
细胞膜的成分中含有蛋白质，而胰蛋白酶能够水解蛋白质，因此，胰蛋白酶会把细胞消化掉。因此，胰蛋白酶处理的时间不能太长。
3. 动物细胞培养的过程
动物组织
分散成单个细胞
机械法：胰蛋白酶
胶原蛋白酶处理
一.动物细胞培养的条件及过程
3. 动物细胞培养的过程
动物
组织块
分散成
单个细胞
机械法
胰蛋白酶
胶原蛋白酶处理
加培养液
细胞悬液
体外培养的动物细胞分为两类：
一类细胞能够悬浮在培养液中生长增殖，称为悬浮生长。
另一类则需要贴附于某些基质表面才能增殖，大多数细胞属于这种类型，称为贴壁生长。
细胞贴壁：在培养瓶悬液中分散的细胞需要贴附于某些基质表面才能增殖，这类细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上，这种现象称为细胞贴壁。
用培养液将分散的细胞制成细胞悬液，再将细胞悬液放入培养皿或培养瓶内，置于适宜环境中培养。
培养瓶或培养皿壁要求：表面光滑、无毒、易于贴附。
一.动物细胞培养的条件及过程
细胞贴壁现象
一.动物细胞培养的条件及过程
动物
组织块
分散成
单个细胞
机械法
胰蛋白酶
胶原蛋白酶处理
加培养液
细胞悬液
原代培养
传代培养
放入培养瓶
在适宜条件中
在适宜条件中
分瓶培养
原代培养
传代培养
将分瓶之前的细胞培养，即动物组织经过处理后的初次培养称为原代培养。
将分瓶后的细胞培养称为传代培养。
思考：为什么要进行分瓶培养？
a.悬浮培养的细胞会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素而分裂受阻。
b.贴壁细胞在生长增殖时，除受上述因素的影响外，还会发生接触抑制现象，即当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增殖。
一.动物细胞培养的条件及过程
动物
组织块
分散成
单个细胞
机械法
胰蛋白酶
胶原蛋白酶处理
加培养液
细胞悬液
原代培养
传代培养
放入培养瓶
在适宜条件中
在适宜条件中
分瓶培养
思考：进行传代培养时，如何处理？
悬浮培养的细胞直接用离心法收集；
贴壁细胞需要重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集。之后，将收集的细胞用培养液制成细胞悬液，分瓶培养。
思考：用胰蛋白酶两次处理的目的是？
第一次处理的目的是使组织细胞分散开；
第二次处理的目的是使细胞从瓶壁上脱离下来，便于分瓶后继续培养。
一.动物细胞培养的条件及过程
思考：“细胞增殖到互相接触的时候，糖蛋白识别了这种信息，就会使细胞停止继续繁殖，出现接触抑制的现象”试结合上述解释，举例说明哪种细胞无接触抑制现象，并阐述原因。
癌细胞；癌细胞的细胞膜上糖蛋白等物质减少
肿瘤细胞失去接触抑制，
条件适宜在培养液可以无限增殖下去。
一.动物细胞培养的条件及过程
取动物组织
分散成单个细胞
解决
悬浮生长
贴壁生长
(大多数）
细胞密度过大、有害代谢物积累、营养物质缺乏等
接触抑制
传代培养
用机械法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理
细胞悬液
原代培养
分瓶
培养
①原代培养：指动物组织经处理后的初次培养。
②细胞贴壁：某些细胞需要贴附于某些基质表面才能增殖，这类细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上③接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞停止分裂增殖的现象。
④传代培养：分瓶后的细胞培养。
加培养液
在培养皿或培养瓶内
悬浮培养的细胞:直接用离心法收集
贴壁细胞:用胰蛋白酶处理分散成单个细胞，用离心法收集
细胞分裂受阻
②制成细胞悬液，分瓶培养
①收集细胞
一.动物细胞培养的条件及过程
细胞悬浮液
10代细胞
50代细胞
无限传代
原代培养
传代培养
细胞株
细胞系
遗传物质改变
遗传物质可能改变
多数细胞固定在表面生长和分裂
随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖
保持细胞正常二倍体核型
（遗传物质没改变）
思考：正常细胞能否一直传代培养下去？
如何界定原代培养和传代培养？细胞株和细胞系？
一.动物细胞培养的条件及过程
细胞发生了突变，可无限增殖。
传代培养的细胞一般传至10代左右，细胞的生长就会出现停滞，大部分细胞衰老死亡。但极少数细胞能存活下来并继续传下去，一般还可以顺利地传至40～50代，部分细胞的细胞核型可能会发生改变。
一般情况下，当细胞传至50代以后会再次出现停滞，不能再传代。但有少部分细胞会克服细胞寿命限制，获得不死性，遗传物质发生改变，并朝着等同于癌细胞的方向发展，从而有可能在培养条件下无限制地传下去（不死性）。
细胞株：传代培养的10代以后的细胞，也就是能传至40～50代的细胞
细胞系：超过50代的细胞（带有癌变的特点）
动物细胞培养技术常将细胞培养至10代以内。能保持正常的二倍体核型。
一.动物细胞培养的条件及过程
比较项目 植物组织培养 动物细胞培养
原理
培养基
培养基特有成分
过程
结果
相同点 固体培养基
葡萄糖、动物血清
液体培养基
细胞增殖
植物细胞的全能性
许多细胞
蔗糖、植物激素
①都进行有丝分裂，不涉及减数分裂；
②均需无菌操作，需要适宜的温度、pH等条件
新的植株
外植体
↓脱分化
愈伤组织
　 ↓再分化
芽、根或胚状体
↓生长发育
植物体
动物的组织
　　　　　 ↓ 机械法或胰蛋白酶、
↓ 胶原蛋白酶处理
细胞悬液
↓
原代培养
↓
细胞悬液
↓
传代培养
小结
(1)动物细胞培养体现了动物细胞的全能性(　　)
(2)培养保留接触抑制的细胞在培养瓶壁上可形成多层细胞(　　)
(3)悬浮培养的细胞直接用离心法收集，贴壁细胞需要用胰蛋白酶等处理后再用离心法收集(　　)
(4)动物细胞培养时，O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH(　　)
×
√
判断正误
×
√
课堂练习p27
解析：
（1）动物细胞培养的原理是：细胞的增殖
（2）由于接触抑制所以在培养瓶壁上形成的应该是单层细胞。
1.(2022·天津一中高二期中)一般来说，动物细胞体外培养需要满足以下条件
①无毒的环境　②无菌的环境　③只使用合成培养基　④温度与动物的体温相近　⑤因在CO2培养箱中培养，故不需要O2　⑥多数动物细胞培养在7.2～7.4的pH环境
A.①②④⑤⑥ B.①②③④
C.①②③⑤⑥ D.①②④⑥
√
＋血清
O2细胞代谢所必需的，维持培养液PH，
课堂练习p28
2.在将动物组织块分散成单个细胞时，可以使用胰蛋白酶。由此判断以下推测不合理的是
A.动物细胞之间可能依靠蛋白质相互联系
B.处理时一定要注意处理时间、加酶量
C.胰蛋白酶一定不会对动物细胞造成损伤
D.动物细胞培养液的pH应与胰蛋白酶作用的适宜pH基本一致
√
细胞膜的成分中含有蛋白质，而胰蛋白酶能够水解蛋白质，因此，胰蛋白酶处理的时间太长，会把细胞消化掉。
课堂练习p28
【学生活动】
阅读教材46页“干细胞培养及其应用”的内容，思考、回答下列问题：
什么是干细胞？
它有哪些类型？
这些类型各有怎样的特点和哪些方面的应用？
二.干细胞的培养及其应用
（3）分布：
（1）概念：
（4）分类：
电镜下的胚胎干细胞
存在于早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中。
按来源：胚胎干细胞和成体干细胞等。
按分化潜能：全能干细胞、多能干细胞、专能干细胞
动物和人体内仍保留的少数具有分裂和分化能力的细胞。在一定条件下，干细胞可以分化成其他类型的细胞。
（2）特点：
体积较小，细胞核大，核仁明显。
1.干细胞
二.干细胞的培养及其应用
早期胚胎中具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。胚胎干细胞分布特点应用实例自1981年科学家首次分离得到小鼠的ES细胞后，目前科学家在已经分离了兔、牛、猴和人等的ES细胞，并证明ES细胞可以在体外分化成心肌细胞、神经元细胞和造血干细胞等局限性必须从胚胎中获取 ，涉及伦理问题；因而限制了在医学上的应用。ES细胞2、胚胎干细胞二.干细胞的培养及其应用成体组织或器官内骨髓中的造血干细胞（外周血和脐带血中）神经系统中神经干细胞睾丸中精原干细胞具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力成体干细胞分布举例特点利用神经干细胞在治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）将正常的的干细胞移植到病人体内，恢复病人的造血和免疫功能，治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病造血干细胞→神经干细胞→治疗细胞损伤造成的疾病3、成体干细胞应用实例有着自我更新能力及分化潜能的干细胞，与组织、器官的发育、再生和修复等密切相关。二.干细胞的培养及其应用通过体外诱导小鼠成纤维细胞得到的类似胚胎干细胞的一种细胞称为诱导多能干细胞，简称iPS细胞。①将特定基因或特定蛋白导入细胞（成纤维细胞、已分化的T细胞、B细胞）诱导多能干细胞概念制备方法应用优点②用小分子化合物诱导形成。①诱导过程无须破坏胚胎；②iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应。可治疗镰状细胞贫血症；在治疗阿尔兹海默病、心血管疾病等领域的研究也取得了新进展iPS细胞二.干细胞的培养及其应用移植
取成纤维细胞等
iPS细胞
转入相关因子
细胞发生转化
分化
胰岛细胞
神经元
血细胞
肠上皮细胞
心肌细胞
肝细胞
病人
iPS细胞用于治疗人类疾病示意图
二.干细胞的培养及其应用
二.干细胞的培养及其应用
无菌、无毒
营养
温度、pH和渗透压
气体环境
制备细胞悬液
原代培养
传代培养
动物细胞培养
动物细胞培养的条件
动物细胞培养的过程
干细胞的培养和应用
干细胞的种类、特点及应用
iPS细胞的培养和应用
课堂小结
(1)干细胞都是来源于早期胚胎 （ ）
胚胎干细胞是早期胚胎或原始性腺中分离出来的一类细胞。干细胞不一定来自胚胎，如造血干细胞。
(2)iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，可以避免免疫排斥反应。 （ ）
(3)不同类型的干细胞,它们的分化潜能完全相同 （ ）
(4)干细胞将在再生医学、药物安全性与有效性检测等领域发挥大作用。 （ ）
×
×
√
√
胚胎干细胞的分化潜能大于成体干细胞
课堂练习p28
3.(2022·北京顺义高二期末)目前实验室培养的小鼠干细胞经过定向诱导分化，可成功地修复小鼠损伤的心脏，下列相关叙述正确的是
A.此项研究体现了细胞的全能性
B.在培养干细胞时需通入O2，不需通入CO2
C.干细胞具有免疫力，不需要在无菌环境中培养
D.此成果的应用可避免器官移植出现的免疫排斥
√
解析：A.没有形成完整个体，也没有分化成其他各种细胞，不
能体现细胞的全能性
B.在培养干细胞时需通入95%空气(细胞代谢必需的)和5%的CO(维持
培养液的pH)
C.干细胞需要在无菌环境中培养
D.患者自身细胞制备的干细胞，在体外分化培养出某种组织细胞，并
植入患者体内，此成果的应用可避免器官移植出现的免疫排
课堂练习p29
4.肌萎缩性侧索硬化症即“渐冻症”，该病病因之一是突变的基因导致有毒物质积累，运动神经元损伤。最新研究结果表明，利用诱导多能干细胞(iPS细胞)制作前驱细胞，然后移植给渐冻症实验鼠，能延长其寿命。下列关于诱导多能干细胞的叙述，不正确的是
A.iPS细胞分化的实质是基因的选择性表达，细胞种类增多
B.iPS细胞分化成的多种细胞中所有核酸均相同，蛋白质却不完全相同
C.若将突变的相关基因替换，或许可以起到治疗该病的作用
D.经体外诱导产生造血干细胞，在小鼠骨髓中能够增殖分化出B细胞
√
解析： A.细胞分化的实质是基因的选择性表达，细胞种类增多，
B.细胞分化形成的多种细胞中DNA相同，但mRNA不完全相同，
蛋白质也不完全相同
C.B细胞是由造血干细胞增殖分化形成的，经体外诱导产生的造
血干细胞，在小鼠骨髓中能够增殖分化出B细胞
课堂练习p29
1.判断下列有关动物细胞培养的表述是否正确。
（1）培养环境中需要O2，不需要CO2 。（ ）
（2）细胞要经过脱分化形成愈伤组织。（ ）
（3）培养液中通常含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素和动物血（ ）
（4）培养瓶中的细胞需定期用胰蛋白酶处理,分瓶后才能继续增殖（ ）
一.概念检测
×
√
×
×
练习与应用（课本P47）
2.干细胞有着广泛的应用前景。下列相关叙述错误的是( )
A.干细胞是从胚胎中分离提取的细胞
B.造血干细胞可以分化为各种血细胞
C.不同类型的干细胞,它们的分化潜能是有差别的
D.由iPS细胞产生的特定细胞,可以在新药的测试中发挥重要作用
A
胚胎干细胞是早期胚胎或原始性腺中分离出来的一类细胞。干细胞不一定来自胚胎，如造血干细胞。
现在关于iPS细胞的研究正在不断深入。请你从以下两个方面来查阅资料进行思考。（1）由于诱导iPS细胞、促使其分化都需要时间，因此用某人特异的iPS细胞进行医疗只限于时间比较充裕的情形。从实际事故、疾病发生的不可预测性方面考虑，如果要将这些细胞用于紧急情况，应该提前采取什么措施
像建立骨髓库一样，有研究团队正在尝试建立HLA(Human Leukocyte Antigen,人类白细胞抗原)多态性丰富的iPS细胞库，可以为需要的人找到HIA匹配度较高的iPS细胞，这样不仅可以节省时间、成本，还能减轻异体干细胞移植后发生的免疫排斥反应。
（2）如果诱导iPS细胞定向分化为生殖细胞的技术发展成熟，该技术可能会有哪些应用？又可能带来哪些问题？
该技术可能被用于治疗不孕症；获得足够量的生殖细胞来进行濒危物种的克隆研究；获得生殖细胞进行转基因操作，再经过受精、胚胎发育等过程来获得转基因动物。该技术可能带来一系列的伦理问题。例如，如果用同一个人的iPS细胞分别诱导形成精子和卵子，两者受精可能培育出“单亲”婴儿；有的人还可能有目的地选择iPS细胞，从而“设计”婴儿。
二.拓展应用
练习与应用（课本P47）

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