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第2节 动物细胞工程
第2课时：动物细胞融合技术与单克隆抗体
第二章
植物体细胞杂交
植物细胞融合
植物组织培养
温故而知新：
意义：打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种。　　　　　
温故而知新：
用发绿色荧光的染料标记小鼠细胞表面的蛋白质
用发红色荧光的染料标记人细胞表面的蛋白质
1970年荧光标记的人-鼠细胞融合实验模式图：
1、概念：
使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。
4、结果：
形成杂交细胞。即融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞。
2、原理：
细胞膜的流动性
3、诱导方式
物理法：离心、振动、电激
化学法：聚乙二醇（PEG)
生物法：灭活的病毒诱导法
与植物原生质体融合的基本原理相同
与植物原生质体融合的方法相同
——动物细胞融合特有
一.动物细胞融合技术
灭活病毒诱导细胞融合的原理
【拓展】
灭活：指用物理或化学手段使病毒失去感染能力（不感染细胞），
但是并不破坏病毒的抗原结构（诱导细胞融合）。
原理：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞相互凝集，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
病毒颗粒
灭活的病毒颗粒粘附于细胞表面
细胞膜融合
细胞核融合
形成杂交瘤细胞
在病毒的作用下细胞膜打开
一.动物细胞融合技术
动物细胞融合动物细胞培养细胞膜的流动性细胞增殖灭活病毒诱导细胞融合的原理【拓展】一.动物细胞融合技术思考：19世纪30年代，科学家曾在肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中观察到多核细胞。如何解释这一现象？
病人体内病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。
肺结核病人病理切片
一.动物细胞融合技术
PEG融合法
PEG可以使原生质体的膜位降低，然后，原生质通过钙离子交联促进凝聚。另外，由于PEG的脱水作用，扰乱了分散在原生质膜表面的蛋白质和脂质的排列，提高了脂质颗粒的流动性，从而促进原生质体融合。
电融合法，是指利用电场来诱导细胞彼此连接成串，再施加瞬间强脉冲促使质膜发生可逆性电击穿促进细胞融合的技术，是最常采用的物理诱导细胞融合的方法
电融合法
【拓展】
一.动物细胞融合技术
7.意义：
5.动物细胞融合的过程：
细胞膜融合
细胞核融合
细胞质融合
细胞融合的实质
6.动物细胞融合完成的标志：
两个或多个细胞核融合为一个细胞核
突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能。
8.应用：
至今，种间、属间、科间，甚至动物和植物之间的细胞融合都已获得成功。
研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。
为制造单克隆抗体开辟了新途径。
一.动物细胞融合技术
比较项目 植物体细胞杂交 动物细胞融合
基本原理
融合前处理
诱导方法
用 途
意 义
细胞膜的流动性、
植物细胞的全能性
细胞膜的流动性
用纤维素酶、果胶酶去壁后，诱导原生质体融合
用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散后诱导细胞融合
培育新品种
制备单克隆抗体
物理法：电融合法、离心法
化学法：PEG，高Ca2+ —高PH融合法
电融合法，PEG融合法，灭活的病毒
植物体细胞杂交和动物细胞融合比较
打破生殖隔离，实现远缘杂交育种
突破有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能
一.动物细胞融合技术
(1)与植物原生质体融合相比，动物细胞融合特有的诱导因素有聚乙二醇(PEG)、灭活的病毒(　　)
(2)灭活的含义是用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构(　　)
(3)二倍体动物细胞融合后的杂交细胞仍然是二倍体细胞(　　)
×
√
判断正误
×
动物细胞融合特有的诱导因素是灭活的病毒
四倍体
课堂练习p30
1.(2022·天津市高二阶段练习)如图表示仙台病毒诱导动物细胞融合的部分过程，下列叙述正确的是
A.细胞A和细胞B必须为同种细胞才能融合
B.细胞C同时有细胞A和细胞B的遗传物质
C.该融合过程体现了细胞膜具有选择透过性
D.此过程的原理是动物细胞具有全能性
√
解析：A.不同种的细胞也能融合,如人、鼠细胞融合
B.细胞A、B融合成一个细胞，细胞C同时有细胞A和细胞B的遗传物质
C.动物细胞融合过程体现了细胞膜具有流动性
D.动物细胞融合的原理是动物细胞膜具有流动性，
课堂练习p31
2.对比动物细胞融合和植物体细胞杂交技术，下列论述合理的是
A.均可使用PEG、电融合或灭活病毒诱导细胞融合
B.两者都可以跨越种属间的生殖隔离
C.两者都可以体现细胞的全能性
D.在适宜的条件下，均可产生完整个体
√
C.植物体细胞杂交的原理是：细胞膜的流动性和细胞的全能性
动物细胞融合是：细胞膜的流动性
D.动物细胞融合不产生完整个体
课堂练习p31
（已免疫）B淋巴细胞
能产生抗体
肿瘤细胞
能无限增殖
回顾旧知：抗体
第1节学习的植物体细胞杂交技术跨越不同种植物之间生殖隔离的屏障，克服远缘杂交不亲和的障碍，培育出新的作物类型。　　　　　
思考：有没有技术让这两种细胞杂交，培育出既能产生抗体，双能大量增殖的细胞呢？
要制备单克隆抗体，就需要找到一种能分泌抗体且增殖能力强的细胞。
什么细胞能产生抗体？
能产生抗体的细胞能否大量无限增殖？
什么细胞具有无限增殖的能力？
能否培养出一种能分泌抗体且增殖能力强的细胞？
二.单克隆抗体技术及其应用
①.抗体的定义：
机体受抗原刺激后产生的，能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。
②.抗体的分布：
（1）血清（主要）
（2）组织液及外分泌液（如乳汁中，为新生儿提供抗体）
③.机体通过什么免疫过程分泌抗体？
体液免疫
1.传统抗体制备方法及缺陷
二.单克隆抗体技术及其应用
缺陷：制备的抗体一般为多克隆抗体，产量低、纯度低，且抗体的特异性差、灵敏度低。
不能无限增殖产生大量抗体
动物体内
抗原
刺激
浆细胞
抗体
筛选单一B细胞
增殖分化
抗原不纯
抗原不纯
如何解决这个问题呢？
④.传统抗体的生产方法
向动物反复
注射某种抗原
使动物
产生抗体
从动物血清中分离所需抗体
二.单克隆抗体技术及其应用
为了解决这一难题，科学家进行了多年的研究和探索。他们发现，哺乳动物感染病原体后，体内会形成相应的B淋巴细胞，这些细胞能分泌抗体，抗体识别并特异性结合病原体，从而抑制病原体的增殖等。动物体内产生的特异性抗体的种类超过百万种，但每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。因此，要想获得大量的单一抗体，必须克隆单一的B淋巴细胞，形成细胞群。遗憾的是，在体外培养条件下，一个B淋巴细胞是不可能无限增殖的，怎样解决这一问题呢
二.单克隆抗体技术及其应用
把一种B淋巴细胞与能在体外大量增殖的骨髓瘤细胞融合，所得到的融合细胞就可能大量增殖，产生足够数量的特定抗体。
米尔斯坦
【英国】
科勒
【德国】
二.单克隆抗体技术及其应用
动物细胞融合
杂交细胞
动物细胞培养
单克隆抗体
骨髓瘤细胞（癌细胞）能无限增殖
一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体
1975年，米尔斯坦和柯勒
1984年，诺贝尔生理学或医学奖
杂交瘤细胞
既能迅速大量增殖，又能产生专一抗体
一个极富创造力的方案
二.单克隆抗体技术及其应用
动物细胞融合杂交细胞动物细胞培养单克隆抗体骨髓瘤细胞（能无限增殖）一种B淋巴细胞（只分泌一种特异性抗体）杂交瘤细胞既能迅速大量增殖，又能产生专一抗体单克 隆抗 体一个B淋巴细胞细胞群抗体克隆一个极富创造力的方案二.单克隆抗体技术及其应用活动：阅读课本P48页单克隆抗体的制备过程
2、单克隆抗体的制备过程
注射特定抗原
从脾脏中获取B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
培养骨髓瘤细胞
目的是获得产生特定抗体的B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
与B淋巴细胞融合
诱导融合
多种杂交细胞
选择培养基培养
筛选杂交瘤细胞
杂交瘤细胞
既能迅速大量增殖
又能产生抗体
特点
第一次筛选
二.单克隆抗体技术及其应用
知识拓展：第一次筛选获得杂交瘤细胞
①细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基喋呤阻断。
②人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但不能分裂增殖。
③鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径，但能不断分裂增殖。
筛选出杂交瘤细胞方法？
B淋巴细胞及同型融合细胞
不能无限增殖，死亡
骨髓瘤细胞及同型融合细胞
不能无限增殖，死亡
杂交瘤细胞
能无限增殖，生长
培养基中加入氨基喋呤
二.单克隆抗体技术及其应用
2、单克隆抗体的制备过程
杂交瘤细胞
第二次筛选
96孔板培养和筛选
筛选抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞
克隆化培养和抗体检测
既能迅速大量增殖
又能产生特异性抗体
特点
在体外培养
注射到小鼠腹腔内
培养液中获取
从腹水中获取
单克隆抗体
获取单克隆抗体
二.单克隆抗体技术及其应用
多孔细胞培养板抗体检测的方法——抗原-抗体杂交法将杂交瘤细胞群稀释，约每孔1个细胞进行培养（克隆化培养）一段时间后，检测各孔上清液中细胞分泌的抗体上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔抗体检测板分泌抗体能跟特定抗原结合的细胞即为所需杂交瘤细胞阳性孔检测原理：抗原和抗体能够特异性结合阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行3～4次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。二.单克隆抗体技术及其应用诱导其融合的方法有哪些？
注射抗原的目的是什么？
大量增殖杂交瘤细胞获得单抗的方法
两次筛选的目的
获得能产生相应抗体的B淋巴细胞
物理:电融合法
化学:聚乙二醇
生物：灭活的病毒
第1次筛选得到杂交瘤细胞（多种）。
第2次筛选得到能产生所需抗体的杂交瘤细胞。
体外培养或注射到小鼠腹腔内增殖。
B淋巴细胞
B淋巴细胞
注射抗原
骨髓瘤细胞
融合
B-B细胞
杂交瘤细胞
瘤-瘤细胞
选择性培养基 筛选1
多种杂交瘤细胞
符合要求的杂交瘤细胞
抗原-抗体
杂交法
筛选2
克隆化培养
体外培养
小鼠腹腔内增殖
单克隆抗体
2、单克隆抗体的制备过程
二.单克隆抗体技术及其应用
杂交瘤细胞特点
既可以产生特异性抗体，又可以大量增殖
单克隆抗体制备中包括几个阶段？
动物细胞融合、动物细胞培养
原理
细胞膜的流动性、细胞增殖
单克隆抗体的优点：
(1)能准确地识别抗原的细微差异。
(2)与特定抗原发生特异性结合。
(3)可以大量制备。
B淋巴细胞
B淋巴细胞
注射抗原
骨髓瘤细胞
融合
B-B细胞
杂交瘤细胞
选择性培养基 筛选1
多种杂交瘤细胞
符合要求的杂交瘤细胞
抗原-抗体
杂交法
筛选2
克隆化培养
体外培养
单克隆抗体
小鼠腹腔内增殖
2、单克隆抗体的制备过程
二.单克隆抗体技术及其应用
【两次筛选的比较】
项目 第一次筛选 第二次筛选（需要多次筛选）
筛选原因
筛选方法
筛选结果
诱导融合后得到多种杂交细胞，还有未融合的细胞等。
用特定的选择培养基筛选：未融合的亲本和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。
得到杂交瘤细胞
因为小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经选择培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞
用96孔板培养，在每个孔中尽量接种一个杂交瘤细胞的情况下进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选得到足够数量的能分泌所需抗体的细胞
得到能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
二.单克隆抗体技术及其应用
【培养杂交瘤细胞的方法比较】
项目 腹腔培养 体外培养
优点
缺点
易于控制培养条件（如无需提供无菌环境等），操作简单，成本较低
规模小，产量少
可大规模培养，大量生产
需要人为控制培养条件，成本相对较高
2、单克隆抗体的制备过程
二.单克隆抗体技术及其应用
①.诊断试剂——最广泛应用抗原-抗体杂交法抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体在妊娠第8天就可以作出诊断，比原来诊断方法提前了10d左右，准确率在90﹪以上。具有准确、高效、简易、快速特点诊断优点：3.单克隆抗体的应用二.单克隆抗体技术及其应用乙肝测定试剂艾滋病检测试剂血型检测试剂新冠病毒检测试剂二.单克隆抗体技术及其应用细胞凋亡
①
ADC被细胞吞噬
②
⑤
ADC
抗体
药物
接头
实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。
②运载药物
单克隆抗体+接头+药物（如细胞毒素）=ADC（抗体-药物偶联物）
主要用于癌症治疗。
优点：位置准确、疗效高、副作用小
单克隆抗体+药物 =“生物导弹”
二.单克隆抗体技术及其应用
单克隆抗体+同位素（荧光标记）②.运载药物在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。结合荧光标记的单克隆抗体药物3、治疗疾病医药领域，单抗类药物占用重要地位二.单克隆抗体技术及其应用(1)B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后，得到的都是杂交瘤细胞(　　)
(2)单克隆抗体制备过程中两次筛选的目的相同(　　)
(3)ADC的抗体具靶向运输作用、药物具有治疗作用(　　)
×
×
判断正误
√
不都是杂交瘤细胞，还有B细胞自身融合的细胞、骨髓瘤细胞自身融合的细胞
第一次筛选：杂交瘤细胞
第二次筛选：能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
课堂练习p31
3.新型冠状病毒表面的刺突蛋白(S蛋白)与人呼吸道黏膜上皮细胞ACE2受体结合，入侵细胞后可引起肺炎。针对此环节研发单克隆抗体是治疗新冠肺炎的研究热点之一，下列相关叙述错误的是
A.①过程需多次向小鼠体内注射S蛋白，以便于从
脾脏中获得致敏的B淋巴细胞
B.②过程可通过电融合法使两个细胞融合
C.经③过程筛出的细胞既能无限增殖又能产生识别
S蛋白的单克隆抗体
D.S蛋白的单克隆抗体能够阻断病毒入侵正常细胞以减弱对机体的毒害
√
解析：C.经③过程筛出的细胞只是杂交瘤细胞，该类细胞可以无 限增殖,但不一定均可产生识别S蛋白的单克隆抗体,还需经过抗体检测和克隆化培养.
课堂练习p32
4.抗体—药物偶联物(ADC)通过将细胞毒素与单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤，过程如图所示。下列叙述不正确的是
A.抗体进入细胞后激活溶酶体酶，
导致细胞凋亡
B.ADC可通过胞吞方式进入肿瘤细胞
C.单克隆抗体携带细胞毒素与肿瘤细胞特异性结合
D.肿瘤细胞凋亡是细胞主动死亡的过程，会产生新的蛋白质
√
解析：A.抗体进入细胞后被溶酶体裂解,释放的药物导致细胞凋亡
B/C.单克隆抗体携带细胞毒素与肿瘤细胞膜上的特异性受体结合
D.肿瘤细胞凋亡是细胞主动死亡的过程，细胞凋亡过程中基因进行选择性表达，因此会产生新的蛋白质
课堂练习p32
一、概念检测
1. 下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的是 （ ）
A. 它们的原理都涉及细胞膜的流动性
B. 都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合
C. 融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞
D. 前者主要为了获得细胞产品，后者主要为了获得杂种植株
C
课本P51
解析：A.动物细胞融合的原理是细胞膜具有流动性，植物体细胞杂交的原理是细胞膜具有流动性和细胞的全能性
B、动物细胞融合与植物体细胞杂交都可用电融合法或聚乙二醇作为融合诱导剂
C、植物体细胞杂交需要用纤维素酶或果胶酶处理细胞，而动物细胞融合前用胰蛋白酶处理
D、动物细胞融合主要是为了获得细胞产品，如单克隆抗体，后者主要是为了获得杂种植株
2. 科学家以SARS病毒的核衣壳蛋白为抗原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确的是 （ ）
A. 利用该单克隆抗体可以诊断是否感染 SARS病毒
B. 体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对SARS病毒的单克隆抗体
C. 将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合,经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞
D. 将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，从小鼠血清中分离出的抗体为单克隆抗体
A
课本P51
解析：A、单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高的特点，因此利用该单克隆抗体与SARS病毒核衣壳蛋白特异性结合的方法可诊断出病毒感染者
B、单个效应B细胞有产生抗体的能力，但没有无限增殖的本领，因此在体外培养单个效应B细胞不能获得大量针对SARS病毒的单克隆抗体
C、不都是杂交瘤细胞，还有B细胞自身融合的细胞、骨髓瘤细胞自身融合的细胞等
D 用纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，使其产生免疫反应，以获得相应的B细胞，从小鼠血清中分离的抗体数量少，不是单克隆抗体
二、拓展应用
假如你掌握了动物细胞融合技术，你想用这种技术来解决哪些问题？解决这些问题的大致思路是怎样的？这样做会有什么风险？请查阅相关资料，完善自己的思路，并形成文字报告，与同学交流。
可以利用动物细胞融合技术培育多倍体胚胎,研究其发育机制,甚至可能培育出新的物种。但是,目前相关技术还不成熟,存在融合率低、胚胎死亡率高等问题,并且还可能带来些伦理方面的问题。
课本P51
单克隆抗体制备过程中的相关考点总结
（1）该过程中应用到的技术_______________________________________
（2）原理_______________________________________
（3）注射特定抗原的目的
______________________________________________
（4）诱导融合的方法____________________
动物细胞特有的诱导融合方法为_______________________
动物细胞融合、动物细胞培养
细胞膜的流动性、细胞增殖
用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞
PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法
灭活病毒诱导法
（5）第一次筛选的目的______________________
第一次如何筛选___________________________
筛选原理____________________________________________________
_____________________________
筛选获得杂交瘤细胞
用特定的选择培养基进行筛选
在选择培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长
（6）杂交瘤细胞的特点__________________________________
（7）第二次筛选的目的________________________________________________
如何筛选_______________________________________ ____________
选择抗体检测呈___性的杂交瘤细胞，即_____________ _____________
（8）抗体检测原理_______________________________________
获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
进行克隆化培养和抗体检测（进行多次筛选）
分泌的抗体能与特定的抗原结合
抗原和抗体能够特异性结合(分子水平的鉴定）
既能迅速大量增殖，又能产生抗体
（9）如何获取大量所需杂交瘤细胞__________________________________________
（10）如何获取单克隆抗体
①体外培养___________________________
②小鼠腹腔内培养_________________________
（11）单克隆抗体的优点_____________________________
_________________________________________________
在体外条件下大规模培养（接种于培养液中）或注射到小鼠腹腔内增殖
从细胞培养液中获取
从小鼠腹水中获取
能准确地识别抗原的细微差异，
与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备
阳
单克隆抗体制备过程中的相关考点总结

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